基于LC—MS/MS技术研究黄芩苷在脑、血微透析探针体内外回收率

陈腾飞+刘建勋+张颖+林力+宋文婷+姚明江

[摘要] 为进一步研究黄芩苷的入脑行为及脑细胞间液药代动力学，对黄芩苷在脑、血微透析探针的体内外回收率及其稳定性进行了研究。采用LC-MS/MS测定脑、血微透析液中黄芩苷的浓度，计算探针回收率；分别采用增量法、减量法考察不同流速（0.50，1.0，1.5，2.0，3.0 μL·min^-1）对探针体外回收率的影响；采用增量法考察不同浓度（50.00，200.0，500.0，1 000 μg·L^-1）、探针使用次数（0，1，2）对体外回收率的影响；采用减量法考察在大鼠体内探针回收率稳定性及流速对回收率的影响，并与体外结果进行比较。在同一浓度下，黄芩苷的脑、血探针体外回收率均随着流速的增加而降低；在同一流速下，探针回收率与黄芩苷的浓度无关；使用后并经过恢复处理的脑、血探针，在使用2次后，探针的回收率没有明显的变化；增量法和减量法所测得的体外回收率基本相同；减量法测得的体内回收率与体外结果相近，且脑、血探针体内回收率在10 h内的稳定性均良好。研究结果表明减量法能够作为研究黄芩苷体内回收率的测定方法，微透析技术能够用于黄芩苷在脑细胞间液药代动力学、血液药代动力学的同步研究。

[关键词] 黄芩苷；LC-MS/MS；微透析；回收率；脑细胞间液

[Abstract] To further study the brain behavior and the pharmacokinetics of baicalin in intercellular fluid of brain，and study the recovery rate and stability of brain and blood microdialysis probe of baicalin in vitro and in vivo. The concentration of baicalin in brain and blood microdialysates was determined by LC-MS/MS and the probe recovery for baicalin was calculated. The effects of different flow rates （0.50，1.0，1.5，2.0，3.0 μL·min^-1） on recovery in vitro were determined by incremental method and decrement method. The effects of different drug concentrations （50.00，200.0，500.0，1 000 μg·L^-1） and using times （0，1，2） on recovery in vitro were determined by incremental method. The probe recovery stability and effect of flow rate on recovery in vivo were determined by decrement method，and its results were compared with those in in vitro trial. The in vitro recovery of brain and blood probe of baicalin was decreased with the increase of flow rate under the same concentration；and at the same flow rate，different concentrations of baicalin had little influence on the recovery. The probe which had been used for 2 times showed no obvious change in probe recovery by syringe with 2% heparin sodium and ultrapure water successively. In vitro recovery rates obtained by incremental method and decrement method were approximately equal under the same condition，and the in vivo recovery determined by decrement method was similar with the in vitro results and they were showed a good stability within 10 h. The results showed that decrement method can be used for pharmacokinetic study of baicalin，and can be used to study probe recovery in vivo at the same time.

[Key words] baicalin；LC-MS/MS；microdialysis；probe recovery；intercellular fluid of brain

微透析技術（microdialysis，MD）是一种以透析原理为基础的膜取样技术，可以对细胞间隙（extracellular space）中内源性和外源性物质进行活体直接取样[1-3]。与传统的取样技术相比，MD技术具有活体（in vivo）、实时（in time）、在线（on line）、对组织损伤小、高效等优点[4-5]。它能实现连续取样、动态测定体内内源性或外源性物质的变化，对于研究脑内药物代谢动力学过程具有重要意义，且样品因不含蛋白质、酶等大分子物质，可不经预处理直接用于测定[6-9]。

黄芩苷（baicalin，BAI）是由唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根中提取的1种黄酮类化合物，是传统中药黄芩的主要有效成分，具有抗炎、减轻组织缺血再灌注损伤、清除氧自由基和抗氧化、免疫调节、促进细胞凋亡等药理作用[10-13]。近年来随着黄芩苷的深入研究，发现其在治疗缺血性脑中风方面发挥着重要作用[14-16]。为了进一步研究黄芩苷能否透过血脑屏障进入脑组织及其脑细胞间液药代动力学，本文对黄芩苷的脑、血微透析体内外回收率开展了研究。

1 材料

1.1 药品与试剂

黄芩苷（中国食品药品检定研究院，批号110715-201318）；玻璃离子体水门汀（上海医疗器械股份有限公司）；复方氯化钠注射液（林格氏液，华润双鹤药业股份有限公司）；肝素钠注射液（常州千红生化制药股份有限公司，临用前用生理盐水配成质量分数为2%的溶液）；甲醇、乙腈（色谱纯，Merk公司）；甲酸（色谱纯，J.T.BAKER公司）；娃哈哈饮用纯净水（596 mL，杭州娃哈哈集团有限公司，用于流动相配制）；超纯水（用于微透析实验）；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器

API4000 Q-TRAP型三重四极杆串联质谱仪，含Turbo VTM离子源仓、离子喷雾和大气压电离离子源及Analysis 1.4.2数据处理系统（美国Applied Biosystem公司）；Symbiosistm Pico在线固相萃取SPE-LC联用系统（荷兰Spark Holland公司）；CMA 12/4 mm脑微透析探针及套管、CMA 20/10 mm血液微透析探针、CMA 402微透析泵（瑞典CMA公司）；68001型大鼠立体定位仪（美国Stoelting公司）；AG-245分析天平（美国Mettler Toledo公司）；MS1 Minishaker涡流混合器（德国IKA公司）；Integral 3型超纯水系统（美国Millipore公司）。

1.3 动物

SPF级SD大鼠，雄性，250～270 g，购自斯贝福（北京）实验动物科技有限公司，合格证号SCXK（京）2011-0004。

2 方法与结果

2.1 测定条件

色谱条件：色谱柱为Waters Symmetry C₁₈（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流动相为水-甲醇-乙腈（9∶0.5∶0.5，0.01%甲酸，A），甲醇-乙腈（1∶1，0.01%甲酸，1%水，B），梯度洗脱：0～0.2 min，63%A；0.2～1 min，63%～30%A；1～4.8 min，30%A；4.8～6.8 min，30%～63%A；流速0.23 mL·min^-1；柱温25 ℃；进样10 μL。

质谱条件：电喷雾离子化（ESI）；正离子模式检测；多反应监测（MRM）；离子喷射电压5 500 V；源内温度550 ℃；气帘气体：15 psi（1 psi=6.895 kPa）；源内气体1∶40 psi；源内气体2∶50 psi；用于定量的黄芩苷的离子通道为m/z 447.2/271.3。

2.2 溶液的配制

标准溶液配制：称取黄芩苷对照品约2.0 mg，置1.5 mL离心管中，精密加入1.0 mL甲醇，涡旋混合，得相应浓度的对照品甲醇溶液，再用甲醇稀释为1.00 g·L^-1的对照品储备液。精密量取1.00 g·L^-1的黄芩苷对照品储备液1 mL，置100 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，得质量浓度为10.0 mg·L^-1的溶液，再用甲醇将此溶液依次稀释成黄芩苷质量浓度为5 000，4 000，1 000，250.0，120.0，40.0 μg·L^-1的对照品储备液，临用前分别以复方氯化钠注射液将上述6个浓度对照品储备液稀释10倍，得黄芩苷质量浓度为500，400，100，25.0，12.0，4.0 μg·L^-1的标准溶液。

供试品溶液配制：称取黄芩苷对照品5.0 mg，置50 mL量瓶中，加入林格氏液溶解后定容至刻度，得100.0 mg·L^-1的黄芩苷溶液，再用林格氏液将其稀释成质量浓度为1 000，500.0，200.0，100.0，50.0 μg·L^-1的微透析实验用黄芩苷溶液，临用前新鲜配制。

2.3 样品处理

取各浓度的黄芩苷标准溶液以及脑、血微透析样品各25 μL，分别加入等体积的40%甲醇溶液，涡旋混匀，即得。

2.4 线性范围及定量下限

6个浓度的标准溶液按2.3项处理后，按照质量浓度从低到高依次进行测定，以峰面积（Y）作为纵坐标，相应的黄芩苷质量浓度（X）为横坐标，按（1/X2）加权线性回归，得回归方程Y=2 970X-992，r=0.999 0，表明黄芩苷在4～500 μg·L^-1线性关系良好，定量下限为4 μg·L^-1（S/N>10）。

2.5 专属性试验

大鼠麻醉后分別植入脑、血微透析探针，分别以1.5 μL·min^-1的流速灌流林格氏液，平衡60 min后，收集空白透析液并进行测定。之后灌流液改为100 μg·L^-1的微透析试验用黄芩苷溶液，平衡60 min后，收集脑、血微透析液并进行测定，色谱图见图1。结果表明黄芩苷的峰形良好，保留时间为5.1 min，脑、血空白透析液中未见影响黄芩苷测定的干扰物。

2.6 精密度和准确度

参照2.2项方法，依次制备低、中、高（12，100，400 μg·L^-1）3个质量浓度的黄芩苷标准溶液，按照2.3项进行处理，2.1项进行测定，1 d内平行操作5次考察日内精密度和准确度，连续3 d考察日间精密度和准确度，精密度和准确度分别用RSD和RE表示，见表1。

2.7 稳定性

取质量浓度依次为12，100，400 μg·L^-1的黄芩苷标准溶液，每个浓度5个样品，按照2.3项进行处理，2.1项进行测定，12 h后再次测定，考察12 h稳定性。另取低、中、高3个浓度的黄芩苷标准溶液，每个浓度5个样品，在-80 ℃条件下放置3个月后，按照2.3项进行处理，2.1项进行测定，考察3个月稳定性。结果显示，12 h（4 ℃）和3个月（-80 ℃）条件下，低、中、高浓度的峰面积RSD分别为7.0%，1.7%，9.9%和4.4%，3.5%，1.6%，表明微透析液中的黄芩苷在12 h（4 ℃）和3个月（-80 ℃）内相对稳定。

2.8 稀释可靠性

按照2.2项下制备4.0 mg·L^-1的对照品储备液，以林格氏液稀释10倍，按照2.3项进行处理，2.1项进行测定，用质量浓度计算RSD，结果显示在稀释10倍后，黄芩苷的RSD为0.70%，证明稀释10倍后测定的结果可靠。

2.9 基质效应

分别用空白微透析液、超纯水稀释黄芩苷对照品储备液，使黄芩苷的质量浓度分别为12，100，400 μg·L^-1，按照2.3项处理，2.1项测定，分别记录峰面积为A1，A₂，计算基质效应，见表2。结果说明，微透析液中的黄芩苷基本无基质效应。

3 脑、血液微透析探针回收率试验

微透析探针回收率的研究需要测定体外和体内回收率，其中体外回收率有2种常用的测定方法：增量法（正透析法）和减量法（反透析法），增量法能够反映透析针的真实回收率，减量法则用于评价体内回收率和真实回收率的一致性[17]。

3.1 体外回收率试验

3.1.1 灌流速度对探针体外回收率的影响 分别采用增量法和减量法测定并计算体外回收率。增量法：将探针置于200 μg·L^-1的微透析试验用黄芩苷溶液中（恒温37 ℃），分别以0.50，1.0，1.5，2.0，3.0 μL·min^-1的流速灌注林格氏液，每个流速在平衡60 min后，收集5份样品（每份30 μL），样品处理按照2.3项，测定按照2.1项。计算微透析液浓度C_dialysate和原药液中药物浓度C₀，并计算增量法探针回收率（RR）：RR=C_dialysate/C₀×100%，结果见图2。

减量法：将探针置于林格氏液中（恒温37 ℃），分别以0.50，1.0，1.5，2.0，3.0 μL·min^-1的流速灌注200 μg·L^-1的微透析试验用黄芩苷溶液，每个流速在平衡60 min后，收集5份样品（每份30 μL），样品处理按照2.3项，测定按照2.1项。计算微透析液浓度C_dialysate和原药液中药物浓度C₀，并计算减量法探针回收率（RL）：RL=（C₀-C_dialysate）/C₀×100%，結果见图2。

结果显示，在0.50～3.0 μL·min^-1，随着灌流速度的增大，脑、血液微透析探针的回收率均随着流速的增大而下降；相同流速时，2种探针的增量法、减量法测得的回收率均无明显的差异。微透析探针的回收率与透析针半透膜的表面积成正比，而血液微透析探针的半透膜长度为脑微透析探针的2.5倍，因此其回收率也要高于脑微透析探针。

3.1.2 浓度对探针体外回收率的影响 在同一恒定的灌流速度下，测定并计算不同黄芩苷质量浓度回收率，考察浓度对探针体外回收率的影响。依次将探针置于50，200，500，1 000 μg·L^-1的微透析试验用黄芩苷溶液中（恒温37 ℃），以恒定的流速（1.5 μL·min^-1）灌注林格氏液，每个浓度在平衡60 min后，收集5份样品（每份30 μL），样品处理按照2.3项，其中1 000 μg·L^-1质量浓度的样品以林格氏液稀释10后再进行样品处理，其余浓度直接进行样品处理，测定按照2.1项。计算增量法探针回收率RR，结果见图3。

结果显示，当灌流速度不变时，在4种不同药物浓度的溶液中测得的脑、血液微透析探针回收率相似。以回收率对浓度做图，得到与x轴基本平行的线，表明在50～1 000 μg·L^-1，脑、血液微透析探针的回收率与浓度无关。

3.1.3 微透析探针使用次数对体外回收率的影响 选择灌流速度为1.5 μL·min^-1，200 μg·L^-1的微透析试验用黄芩苷溶液，按照3.1.1项增量法分别对新探针、使用1次和2次并经过恢复处理的探针进行体外回收率试验，每个探针在平衡60 min后，收集5份样品（每份30 μL），测定峰面积并计算RR，结果见图4。

结果显示，在使用1次和2次，并经过恢复处理后，脑、血液探针对黄芩苷的回收率与新探针的相比，没有明显的降低，说明探针的恢复处理对其继续使用并保持较高的回收率有重要影响。

3.2 体内回收率试验

3.2.1 脑、血液微透析探针的植入 脑微透析探针的植入：大鼠腹腔注射4%的水合氯醛（10 mL·kg^-1）麻醉，备皮，暴露头部囟门附近面积1～2 cm²的皮肤，切开皮肤，钝性分离皮下组织并擦净，暴露骨面。用立体定位仪固定大鼠头部，标出前囟点，记录前囟点各方向的坐标。在纹状体对应的点（AP+0.050 cm，ML-0.30 cm，DV-0.40 cm）用牙科钻打孔，另钻2孔拧入螺丝钉；在钻孔点植入微透析套管，用牙科水泥将套管连同2个螺钉一并固定。待牙科水泥牢固后，松开立体定位仪，洒入少量注射用青霉素钠粉末，手术区域前后缝皮。术后观察24 h，正常饲水食。实验时先将探针置于超纯水中浸泡约30 min后，以林格氏液或者一定浓度的对照品溶液灌流，排出气泡；取出已植入的探针套管的假针，小心插入准备好的微透析探针，以一定的灌流速度，开始微透析。

血液微透析探针植入：探针使用前，首先将其置于超纯水中浸泡20 min。之后置于2%肝素钠溶液中，并以2.0 μL·min^-1的流速灌流2%肝素钠约30 min。大鼠腹腔注射4%水合氯醛（10 mL·kg^-1），待麻醉后，在大鼠腹部中线靠左约0.5 cm、锁骨附近，备皮，纵向剪口约1.5 cm，找出并钝性分离颈静脉，结扎远心端，并在远心端剪一小口，将血液探针朝心脏方向插入约2.4 cm，并与两旁的肌肉组织缝合以固定探针，缝皮；继续以2.0 μL·min^-1的流速灌流2%肝素钠溶液约30 min后，灌流液更换为林格氏液或者一定浓度的对照品溶液，以一定的灌流速度，开始微透析。

3.2.2 体内回收率稳定性考察 体内药代动力学实验一般需要持续较长的时间，这就需要同一根探针几个小时甚至几十个小时连续取样，取样过程中回收率如果变化不定，就无法得到真实可靠的实验结果[2]。因此，本实验对脑、血液微透析探针体内回收率的稳定性进行了考察。

脑、血液微透析探针的植入按照3.2.1项方法进行，均以1.5 μL·min^-1的流速灌流200 μg·L^-1的微透析试验用黄芩苷溶液，平衡60 min之后，开始收集，每60 min为1份样品，共收集600 min，样品处理按照2.3项，测定按照2.1项进行，计算回收率，结果见图5。

结果表明，当灌流速度为1.5 μL·min^-1时，脑、血微透析探针对黄芩苷的体内回收率在600 min内保持相对稳定，脑探针对黄芩苷的体内平均回收率为21.70%，RSD为1.7%；血液探针对黄芩苷的体内平均回收率为46.70%，RSD为1.7%，均有良好的体内稳定性。

3.2.3 灌流速度对探针体内回收率的影响 按照3.2.1项植入脑、血微透析探针，分别以0.50，1.0，1.5，2.0，3.0 μL·min^-1的流速灌流200 μg·L^-1的微透析试验用黄芩苷溶液，每种流速在平衡60 min后，收集5份样品，样品处理按照2.3项，测定按照2.1项进行，计算回收率，结果见图6。

结果表明，在0.50～3.0 μL·min^-1，随着灌流速度的增加，脑、血微透析探针对黄芩苷的体内回收率均逐渐降低。

4 讨论

微透析作为一种新型生物采样技术，能够在不干扰机体正常生命过程的情况下进行在体、实时、在线取样，根据不同的组织和靶器官，选择不同类型的透析针，可以实现给药后多个部位样品的同时采集，而且基于只允许小分子透过的原理，收集的样品不包含大分子的蛋白和脂质类物质，可以直接进行样品分析[18-19]。微透析探针的回收率是微透析技术用于研究药物体内动力学，尤其是腦细胞间液药代动力学的一个关键问题，而影响回收率的因素有灌流速度、温度、透析膜的性质等，因此探针回收率的研究是其用于进一步研究的首要工作。

灌流速度的快慢直接影响到半透膜两侧物质交换的效率，灌流速度越快，膜两侧物质（内源性小分子和药物成分）的平衡时间越短，导致回收率较低，相反，灌流速度越慢则回收率越高，但是收集的样品量也会相应减少，给检测带来不便。本实验采用增量法和减量法考察了不同流速对黄芩苷探针体外回收率的影响，综合考虑回收率和样品量，最终选择的灌流速度为1.5 μL·min^-1，30 min收集1份样品；结果还表明回收率与灌流速度成反比，且在灌流速度相同的情况下，增量法和减量法测得的探针回收率基本保持一致，说明减量法测得的探针回收率能够代替增量法进行体内校正。

由于体内药物浓度的未知性，通过微透析收集样品检测到的浓度并不能真实反映靶器官内的实际浓度，因此需要通过减量法测定探针的体内回收率，比较与体外回收率的相似性，从而推断体内药物的真实浓度。本实验采用减量法对黄芩苷探针体内回收率进行了考察，同时考察了不同流速对体内回收率的影响，结果同样表明回收率与灌流速度成反比；不同流速下所测得的体内回收率与体外回收率基本一致。

进行动力学实验一般需要考察不同时间点体内药物成分及药效指标的浓度，实验持续时间较长，因此为了得到更准确、科学的实验数据，微透析探针的体内稳定性研究就很有必要。本实验对黄芩苷脑、血探针回收率的10 h稳定性进行了考察，发现探针在体内的稳定性良好。

探针使用并经过再恢复处理后，是否还能够保持较高的透过率，决定着探针能否重复使用。本研究先采用高流速短时间的2%肝素钠溶液冲洗，再低流速长时间的用超纯水冲洗使用后的探针，经上述恢复处理后，再以增量法（1.5 μL·min^-1）进行回收率实验，结果显示使用不超过3次的探针经过上述方法处理后，与新探针相比，仍然能够保持较高的透过率。

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[责任编辑 曹阳阳]