健脾补肾解毒法方药对猴艾滋病的免疫调节作用

张苗苗+符卓韬+陈剑涛+成业+朱伯强+符林春+周红燕

[摘要] 为了评价健脾补肾解毒法中药对猴艾滋病的干预效果。该实验选用8只同期SIV感染恒河猴，随机分为2组：健脾补肾解毒法中药组（以下简称中药组）和抗病毒药组，分别给予中药及抗病毒治疗8周，每4周采集外周血检测。结果显示，健脾补肾解毒法中药虽然不能像HAART一样明显降低血浆病毒载量，但可以升高外周血CD4，该亚群主要为CD4纯真细胞；使CD4和CD8功能细胞数量增加，增强对病原体的免疫应答；在一定程度上延缓了脾虚的出现和进展。表明该药有较好的免疫调节作用，具有相当的临床价值和应用前景。

[关键词] 艾滋病；中药；免疫调节

[Abstract] To evaluate the effect of Chinese medicine of invigorating spleen and kidney detoxification on simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaque. Eight SIV rhesus macaques of the same age were randomly divided into Chinese medicine of invigorating spleen and kidney detoxification group（hereinafter referred to as Chinese medicine group） and anti-virus drug（HAART） group. The traditional Chinese medicine and antiviral therapy were given for 8 weeks，and peripheral blood was collected for detection in every 4 weeks. The results showed that Chinese medicine of invigorating spleen and kidney detoxification could not obviously decrease plasma viral load as HAART，but it can increase CD4 number in peripheral blood，especially the CD4 naive cells，and increase the number of CD4 and CD8 cells，enhance the immune response to pathogens. Therefore，it delayed the occurrence and development of spleen deficiency to a certain extent，indicating that the medicine had immune regulation effect，with considerable clinical value and application prospects.

[Key words] HIV/AIDS；Chinese medicine；immune regulation

众所周知，抗病毒药有诸多的局限性：病毒突变，产生耐药；病毒潜伏，药物无法发挥作用；一旦停药，病毒载量很快就大幅攀升；毒副作用明显，治疗方案复杂。因此研制毒副作用小的新药，既有益于患者，也有助于防止疾病进一步传播。中医药有很大发展空间，因为除了抗病毒治疗，保護机体的免疫细胞生成和成熟的组织环境，本身就是一种治疗，中药提取物成分复杂，为实现多环节、多靶点的调节奠定了基础。中药艾可清作为艾滋病的关爱制剂，在临床上获得了良好的效果，前期研究表明，它能提高患者的生存质量，并延缓HIV感染者进入艾滋病期。故本研究将通过观察健脾补肾解毒法中药对猴艾滋病模型的免疫调节作用，做进一步的研究，以期探索中药的优势所在。

1 材料与方法

1.1 动物 中国产恒河猴8只，全部为雄性。体重4.99～8.14 kg，猴龄4～6岁，动物由广东灵长类实验动物中心提供，许可证号SCXK（粤）2009-0025。试验前经血清学检测SIV、猴逆转录D型病毒（SRV）、猴T淋巴细胞I型病毒（STLV-I）和B病毒抗体阴性，结核菌素阴性，痢疾菌素阴性。以蒸馏水及标准猴饲料为饮食，喂饲于高要市康达实验动物中心获GLP认证的灵长类动物实验室。本实验经广东省灵长类动物实验中心动物伦理委员会批准（文件编号113009-IACUC），实验严格按照广东省灵长类动物实验中心标准操作/作业流程执行。

1.2 感染毒株及途径 SIVmac239，中国科学院昆明动物所郑永唐博士馈赠，5MID100（5个100%猴感染剂量）1 mL静脉注射。

1.3 给药方案 本研究所用中药为经临床观察和猴艾滋病研究证实有效的艾可清复方[1]加味，本方以艾可清加七味白术散为基础，其组成如下：红参10 g，黄芪20 g，白术15 g，茯苓10 g，当归10 g，藿香10 g，木香6 g，葛根6 g，虎杖15 g，毛冬青15 g，黄芩10 g，紫草10 g，淫羊藿15 g，骨碎补10 g，丹参15 g，炮附子6 g，甘草6 g，地榆30 g。制成中药混悬液灌胃；抗病毒药治疗组将PMPA按照30 mg·kg^-1的剂量皮下注射于动物背部；各组均为每天1次，共给药8周。分别在给药0，4，8周采集外周血检测各项指标。

抗病毒药物PMPA（GILEAD GS-1278），9-R-2-Phosphonomethoxypropyl adenine，商品名Tenofovir。配制方法：以蒸馏水溶解至100 g·L^-1，再以NaOH调节pH至7.0，0.2 μm过滤，分装冻存（短期内可保存于4 ℃）。

1.4 血浆SIV病毒载量测定 采集EDTA抗凝全血，分离血浆冻存；按照本课题组已发表的方法，采用自制一管式体液病毒核酸抽提试剂[2]，采用Real-time PCR TaqMan探针法测定。引物及TaqMan探针序列为： SIVprobe：FAM-ACTATGTCCACCTGCCATTAAGCCCGAGA-TAMRA；SIVsense：GGAGGAAATTACCCAGTACAACAAAT；SIVantisense：CCTGAAATCCTGGCACTACTTCT。ABI 7500 Real-time PCR仪检测。

1.5 外周血淋巴细胞亚群的检测 用荧光标记单克隆抗体CD3-APC（SP34-2），CD4-PERCP（L200），CD8-PE（RPA-T8），CD28-FITC（CD28.2），CD45RA-FITC（5H9）均购自美国BD公司；用流式细胞仪（BDFACS Calibur）检测和分析。最后结合血常规的结果，计算各亚群细胞的绝对数。

1.6 血常规和血生化指标 血常规包括白细胞（WBC）、淋巴细胞（LYM）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT），用HORIBA ABX PENTRA 60全自动血细胞分析仪测定；血生化包括谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、血清尿素氮（BUN）、肌酐（CREA），采用EX-3600全自动生化仪测定。

1.7 T3，T4，Cor，β2-MG指标检测 试剂盒由北京北方生物技术研究所提供，由广州中医药大学核医学实验室使用上海原子核所日环仪器一厂放免γ测量仪进行检测。

1.8 LPS检测 用ELISA法检测，试剂盒Multispecies Enzyme Immunoassay for Quantification of free human LBP（Cat.No 044a，Lot：080814），购自Biometec Company for Biomedical Technologies。

1.9 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行数据建立及分析，用配对t检验比较同组前后各指标的差异，用重复测量数据的方差分析比较重复测量数据的时间效应和处理因素对各指标影响的大小。

2 结果

2.1 一般情况 中药组和抗病毒药组动物感染SIVmac239时间均为2013年9月5日，进入本研究时均为感染后15月。治疗前基线状况一致，有可比性，见表1。

治疗过程中临床表现：中药治疗组558号猴给药前经常反复腹泻，给药后腹泻减轻，食欲有改善，但依然有腹瀉，在给药45 d后死亡，解剖所见：消瘦、脱水，左右肺脏轻度淤血，气肿、腹腔有粘连，大肠黏膜充血；抗病毒药组给药7 d后532号和535号猴出现腹泻，540号猴给药7 d后死亡，尸体解剖发现：消瘦、脱水，左右肺叶灰红色肿大，质地变实，肺叶间有粘连，大肠胀气。537号猴在停药21 d后死亡，解剖所见：消瘦，左右肺叶淡褐色肿大，质地变实。考虑540号猴给药时间短，仅7 d，其药物作用效果尚未体现，以下结果数据中均不包含该猴。由于艾滋病猴的个体差异大，且样本量少，有些数据无法进行统计学分析，只能得出其变化趋势。治疗过程中体重的变化见图1。经配对t检验，抗病毒药治疗组给药8周与给药前相比，差异有统计学意义（P<0.05），相比中药组，抗病毒药组体重下降幅度更大。

2.2 安全性评价 治疗过程中，以血常规和血生化指标的变化，作为用药安全性评价，见表2，3，各指标参考范围见国家“十一五”科技重大专项（抗HIV中药复方优化及中医动物模型研究，2008ZX10005-005）中制定的参考值范围[3]。经重复测量资料的方差分析，WBC，LYM，RBC，HGB和PLT时间效应和分组效应P均大于0.05，无统计学意义，可认为WBC，LYM，RBC，HGB和PLT各个时间点和组间无明显差异。治疗过程中，中药组血常规各项指标均在正常参考值范围内，而抗病毒药组WBC和PLT治疗8周时高于正常参考值范围，但无统计学意义。

经重复测量资料的方差分析，CREA，BUN，AST和ALT时间效应和分组效应P均大于0.05，无统计学意义，可认为CREA，BUN，AST和ALT各个时间点和组间无明显差异。治疗过程中中药组血生化各项指标保持正常，其中CREA治疗前高于正常参考值范围，治疗后归于正常；而抗病毒药组治疗过程中4项生化指标均有不同程度异常。

2.3 病毒学方面 中药组血浆病毒载量保持稳定，轻度升高；抗病毒药组显著下降，但经重复测量资料的方差分析，病毒载量的时间效应和分组效应P均大于0.05，可以认为各时间点和组间病毒载量的变化没有明显差异，见表4和图2。

2.4 免疫学方面 各组治疗前后T淋巴细胞亚群的变化：经重复测量资料的方差分析，CD4和CD8数量的时间效应和分组效应P均大于0.05，无统计学意义，可认为中药组和抗病毒药组各个时间点和组间无明显差异。中药组CD4数量显著上升，抗病毒药组CD4数量保持稳定，未见上升；2组CD8数量均有升高，抗病毒药组升高幅度更大。经配对t检验，中药组治疗4周的CD4数量和抗病毒药组治疗4周CD8数量与给药前相比，差异均有统计学意义（P<0.05），见表5。

各组治疗前后T细胞纯真亚群和记忆亚群的变化：经重复测量资料的方差分析，2组T细胞纯真亚群和记忆亚群细胞数量的差异在时间和组间均无统计学意义。经配对t检验，相比治疗前，中药组CD4纯真细胞治疗4周时显著升高（P<0.05）；而抗病毒药组CD8纯真细胞治疗4周相比治疗前亦显著升高（P<0.05），见表6。

各组治疗前后T细胞功能亚群的变化：经重复测量资料的方差分析，2组T细胞功能亚群数量的差异在时间和组间均无统计学意义。经配对t检验，相比治疗前，中药组CD8杀伤性细胞（CD8+CD28+）治疗4周时显著升高（P<0.05），见表7。

2.5 SIV猴模型血清内毒素LPS的变化 血清内毒素LPS：中药组治疗前中位数为19.22 μg·L^-1，治疗后为32.32 μg·L^-1；抗病毒药组治疗前中位数为11.50 μg·L^-1，治疗后为11.30 μg·L^-1。经两独立样本的t检验，组间差异无统计学意义。

2.6 中医证候指标方面 治疗过程中2组的T3均出现下降；中药组T4轻度升高，抗病毒药组T4显著下降组间差异显著（P<0.05）；2组的β2-MG均升高。各指标参考范围参考国家“十一五”科技重大专项（抗HIV中药复方优化及中医动物模型研究，2008ZX10005-005）中制定的参考值范围[3]，见表8。

3 讨论

HIV/AIDS所表现出来的纳差、腹泻、消瘦以及诸多的并发症大多属于脾胃气虚，健运失常，中气下陷，后天衰败，诸证蜂起的病证。在猴艾滋病实验研究中也发现，随着疾病进展，实验猴纷纷出现腹泻、体重下降、摄食改变等脾虚症状，AIDS期出现精神疲倦、蜷缩怕冷、甚至部分水肿、毛发脱落等脾肾俱虚症状。本研究所用的健脾补肾解毒法方药以艾可清加七味白术散为基础，七味白术散配黄芪补中益气，芳香醒脾，斡旋中焦气机，恢复脾胃升清降浊功能，为君药，扶正以固本；虎杖、毛冬青、黄芩、紫草为臣药，清热解毒以治标；淫羊藿、骨碎补、炮附子补命门之火以温煦脾土，丹参、当归补血活血，预防久病气滞血瘀，共为佐；甘草调和诸药为使。

本研究首先对健脾补肾解毒方药的安全性进行了考察。在为期8周的给药过程中，2组实验猴的平均体重均逐渐下降，其中HAART组体重下降幅度略大。此外，HAART组在治疗过程中BUN，ALT指标的均有所增高、并高出正常上限。而中药组血常规和血生化各项指标均在正常参考值范围内，提示中药不会导致肝、肾功能的损伤。随后，按照常规程序，根据治疗前、后血浆病毒载量、CD4的改变情况来评价该方药的疗效。发现，该方药虽然对受试动物的血浆病毒载量无明显影响，但CD4的绝对数较治疗前有明显提升（P<0.05）。这一改变也使得CD4/CD8的比例有增高的趋势。此结果提示，该方药确有提高CD4细胞数的临床价值。为了进一步评价改变CD4的特性，检测了CD4，CD8表达CD45RA的情况。研究发现，治疗后纯真T细胞（CD4+CD45RA+）的数量明显增加。而CD4+纯真细胞的增长是公认的治疗后真正意义上的免疫重建。临床上纯真T细胞的升高多在经过HAART治疗后一年或更晚些时候发生，这也正是许多机会性感染虽经抗病毒治疗仍然发生的一个重要因素。因此，能快速提升纯真T淋巴细胞水平，更体现出健脾补肾解毒方药在免疫重建中的价值。接下去以CD28的表达情况来初步评价中药治疗对T细胞功能可能的影响。结合文献，主要关注CD4+CD28+亚群，与慢性HIV-1感染中对抗原的免疫应答有关[4]，以及CD8+CD28+亚群[5]。研究发现，中药治疗组CD4+CD28+和CD8+CD28+（P<0.05）数量均有增加，提示治疗后CD4和CD8的功能得到增强，该中药可能改善了感染动物对病原体的免疫应答。

结合文献，肠菌移位后血清内毒素LPS升高，而且在艾滋病进展中，必须有病毒复制存在，LPS才会升高[6-7]。本研究中，中药组治疗后LPS中位数轻度升高，提示病毒复制仍在增加，但CD4和CD4纯真细胞数量均上升，推测这可能是实验室和临床上，出现病毒载量没有下降，但实验动物与HIV/AIDS患者仍然表现出症状改善，生存质量提高的原因。抗病毒药组治疗前后LPS中位数持平，提示抗病毒药一定程度上抑制了病毒复制，推测可能与CD8和CD8纯真细胞数量升高有关。这也与中药和抗病毒药作用机制不同一致：中药组重在增强免疫重建，抗病毒药组重在杀伤抑制病毒。

本研究中，中药治疗组出现1只死亡猴，抗病毒药组出现2只死亡猴。抗病毒药能强有力地抑制病毒复制，但有个体差异：研究中540号猴在给药7 d后死亡，537号猴对抗病毒药不敏感，血浆病毒载量一直处于比较高的水平，最后死亡；而另外2只猴对抗病毒药比较敏感：治疗后532号猴病毒载量降低1.5Log，535号猴甚至降至“测不到”的水平。临床上同样如此，HIV/AIDS患者使用抗病毒药物治疗后，部分患者血浆病毒载量能较快降至“测不到”的水平，部分患者病毒复制却一直活跃。中药组血浆病毒载量没有明显下降，提示该药抗病毒力度不够，但除1只平素反复腹泻的558号猴死亡外，其余3只猴存活良好，提示对于免疫系统衰弱的艾滋病晚期猴，免疫重建的重要性丝毫不逊色于抑制病毒复制，此时以压制病毒为优势的HAART治疗并没有中药效果好。

中医证候指标方面，纳入研究的血清T3 （三碘甲腺原氨酸）、T4 （甲状腺素）、Cor（皮質醇）和β2-MG（β2微球蛋白）[8-11]均为反映猴艾滋病模型中医脾虚证候和肾虚证候的指标，治疗过程中2组的T3均出现下降，提示出现脾虚证候；中药组T4轻度升高，抗病毒药组T4显著下降，组间差异显著（P<0.05），提示相比抗病毒药组，中药组一定程度上减缓了脾虚的进程；而已证明与HIV感染及其进展相关的β2-MG[12]在2组均升高，提示艾滋病在进展，而且肾虚证候也开始出现。

综上所述，健脾补肾解毒法中药虽然不能像HAART一样明显降低血浆病毒载量，但可以升高外周血CD4，该亚群主要为CD4纯真细胞；使CD4和CD8功能细胞数量增加，增强对病原体的免疫应答；且在一定程度上延缓了脾虚的出现和发展，均显示了该药有比较好的免疫调节作用，有相当的临床价值和应用前景。

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[责任编辑 张宁宁]