L-色氨酸发酵过程偶联膜分离提取工艺研究

2017-06-09刘镇瑜刘子强蔡萌萌陈宁徐庆阳

生物技术通讯 2017年3期

关键词：糖酸发酵罐色氨酸

刘镇瑜，刘子强，蔡萌萌，陈宁，徐庆阳

代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457

L-色氨酸发酵过程偶联膜分离提取工艺研究

刘镇瑜，刘子强，蔡萌萌，陈宁，徐庆阳

代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457

目的：将发酵过程与膜分离提取过程相偶联，解决现有产酸周期短、乙酸积累较为严重等问题，以提高目的产物的产量，降低代谢抑制物质的积累量。方法：将发酵罐与陶瓷膜分离装置相偶联，在发酵时长21 h、乙酸积累量达到5 g/L时开始膜过滤浓缩菌液，结束后补加透析培养基继续发酵。结果：采用膜偶联发酵技术，与传统发酵工艺相比，菌体生物量提高3.4%，谷氨酸积累量下降54.34%，乙酸积累量下降55.36%。整个发酵过程产酸周期延长了12 h，发酵过程中糖酸转化率提高6.9%。结论：采用膜偶联发酵技术发酵生产色氨酸，可以显著提高色氨酸产量，降低代谢副产物的积累量，延长产酸周期，提高糖酸转化率。

L-色氨酸；膜偶联发酵工艺；乙酸；糖酸转化率

［Key words］L-tryptophan;membrane coupled fermentation technology;acetic acid;glucose conversion rate

L-色氨酸是人体必需的八种氨基酸之一，在人和动物的生长发育、新陈代谢等方面有重要作用，又被称为第二必需氨基酸，广泛应用于食品、医药和卫生行业[1-4]。迄今，L-色氨酸的生产方法主要有酶法、微生物转化法和微生物发酵法[5]，其中微生物发酵法由于具有独特的发展优势而被广泛采用。微生物发酵法生产L-色氨酸的过程中，菌种改造和发酵过程控制优化一直是提高L-色氨酸产量的两个主要研究方向。截至目前，通过菌种改造与发酵过程控制优化等手段，L-色氨酸的产量可以达到54.5 g/L[6]。但是现有发酵过程中，由于乙酸逐渐积累，产酸周期难以延长，细胞活力在中后期也逐渐下降。为了进一步提高L-色氨酸的产量，可以对发酵过程中的生物反应器进行一定的改造。

随着生物反应器技术的发展，将发酵罐与生物分离装置相偶联，发酵罐内的发酵液经过生物分离装置分离之后，浓缩的细胞部分再打回发酵罐内，以保持发酵罐内细胞的高活性状态，可以显著提高发酵生产率[7]。本实验是在L-色氨酸的发酵过程中，将发酵罐与陶瓷膜相偶联，发酵到一定时间之后开始进行膜过滤分离。分离后的发酵清液进入提取工序，浓缩菌液进入发酵罐后补加透析培养基继续发酵。本研究分析了L-色氨酸发酵过程偶联膜分离提取工艺对发酵过程中色氨酸的产率、转化率、谷氨酸积累量、乙酸积累量与碳代谢流变化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌TRTH株由天津科技大学工业微生物菌种保藏室提供；5 L和30 L自动控制发酵罐购自上海保兴生物设备工程有限公司；陶瓷膜浓缩分离系统购自上海戈瑞环境生物工程有限公司；78-1电热恒温培养箱购自湖北省黄石医疗器材厂；P200Ⅱ型或P230高压恒流泵、UV200Ⅱ紫外可见波长监测器、氨基酸专用色谱工作站、ZW型色谱柱恒温箱购自美国Laballiance设备公司；氨基酸专用色谱柱（C18，5μm，250 mm×4.6 mm）购自大连依利特分析仪器公司。

1.2 培养基

①活化斜面培养基（g/L）：葡萄糖1，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母粉5，NaCl 2.5，琼脂条20，pH7.0～7.2；②种子培养基（g/L）：葡萄糖40，酵母粉1，（NH4）2SO41.2，K2HPO45.6，MgSO4·7H2O 2.0，FeSO4·7H2O 2.8 mg/L，MnSO4·H2O 1.2 mg/L，VB13.9 mg/L，VH0.3 mg/L；③发酵培养基（g/L）：葡萄糖0.75，酵母粉1，柠檬酸钠2，K2HPO47.5，Mg-SO4·7H2O 2，FeSO4·7H2O 75.6 mg/L，微量元素1 mL，pH7.0～7.2，消泡剂1 mL/L；④透析培养基（g/ L）：KH2PO42，MgSO4·7H2O 0.33，KCl 2，CTT 0.5，微量元素6 mL；⑤微量元素溶液（mg/L）：钼酸铵0.28，硼酸5，CoCl2·6H2O 1.4，MnSO4·H2O 0.5，CuSO4·7H2O 0.5，ZnSO4·7H2O 0.6。

1.3 培养方法

1.3.1 斜面活化培养取斜面保藏菌种1环，划线接种于活化斜面，37℃恒温培养20～24 h。

1.3.2 种子培养用无菌水冲洗活化斜面5支，并以火焰接种方式接入5 L种子罐，初始通气量1 L/min，搅拌转速200 r/min，温度36℃，自动流加氨水控制pH为7.0，以泡敌消泡，种子培养12 h。

1.3.3 发酵培养以10%的接种量将种子液接种于装有发酵培养基的30 L发酵罐中进行发酵。培养温度36℃，通过调节搅拌转速、通气量与葡萄糖流加速率保持溶氧水平为20%～30%。通过自动流加氨水将pH值维持在7.0（0～20 h）、6.7（20～40 h）。

1.3.4 膜偶联发酵工艺膜偶联发酵工艺可以降低发酵过程中副产物的浓度，减少抑制作用[8]。发酵过程中实时检测乙酸浓度，在乙酸产量大于5 g/L时进行膜过滤。整个分离装置在开启前1 h采用0.1 MPa蒸汽灭菌，灭菌后通入无菌空气保持正压。分离后的发酵清液进入提取工序，浓缩菌液进入发酵罐后补加透析培养基继续发酵。分离过程中停止发酵，维持条件为温度32℃、pH7.0，不流加葡萄糖，分离时间1.5 h（该时间不计入发酵时间）。L-色氨酸发酵过程偶联膜分离提取装置如图1所示。

1.4 分析方法

pH值、菌体浓度、L-色氨酸浓度、葡萄糖浓度及谷氨酸浓度测定参见文献［9］，溶氧水平、乙酸含量测定参见文献［10］。

1.5 代谢流平衡平衡模型的建立

代谢流平衡模型的建立参见文献［11］，L-色氨酸的代谢网络如图2所示，反应速率方程与各步的反应计量化学方程式见附录。

2 结果

2.1 膜偶联发酵工艺对菌体生物量及L-色氨酸产量的影响

色氨酸是细胞代谢产生的初级代谢产物，其产量与细胞数有着密切关系[12]，增加菌体生物量的浓度可以提高色氨酸的产量。采用膜偶联发酵工艺，实时监测乙酸和L-色氨酸的浓度，当发酵时长达到21 h、乙酸浓度接近5.0 g/L、色氨酸浓度达到32.5 g/L时进行过滤，菌体生物量浓度与色氨酸产量如图3所示。可以看出，采用膜偶联发酵工艺，可以明显提高菌体生物量浓度。膜过滤开始后，发酵罐内抑制性底物与副产物浓度都有所下降，低的抑制性物质浓度，使得细胞得以继续生长。采用膜偶联发酵工艺，菌体生物量浓度由52.4 g/L提高到54.2 g/L，相对于普通发酵而言提高了3.4%。采用膜偶联发酵工艺，在21 h开始膜过滤后，由于抑制作用解除，细胞酶活得到恢复，细胞的产酸速率几乎与初始发酵一致。产酸周期延长至44 h，相比普通发酵而言，整个发酵过程产酸周期延长了12 h。

2.2 膜偶联发酵工艺对乙酸及谷氨酸积累的影响

图1 L-色氨酸发酵过程偶联膜分离提取装置

图2 L-色氨酸生物合成代谢网络

图3 膜偶联发酵工艺对生物量及L-色氨酸产量的影响

用膜偶联发酵工艺发酵生产L-色氨酸，乙酸积累量和谷氨酸积累量如图4所示，在整个发酵生产过程中，乙酸积累量与谷氨酸积累量都明显下降。常规单一发酵过程中产生的乙酸很难排出发酵罐，发酵21 h左右乙酸积累达5.6 g/L，严重抑制了色氨酸的继续生产，在后续发酵过程中乙酸的积累量逐渐加大，最大达11.2 g/L，并且发酵液逐渐变黑。而采用膜偶联发酵工艺，在21 h乙酸积累量达到5 g/L时进行膜过滤，发酵液中的乙酸随透析液逐渐被清除出发酵罐。随着发酵透析培养基的加入，乙酸进一步得到稀释。整个发酵过程中，乙酸的积累量都控制在5 g/L以下，为提高色氨酸的转化率提供了一定的条件。由于采用了膜偶联发酵工艺，谷氨酸的积累也得到了一定的抑制。整个发酵过程中，谷氨酸的积累量最高达到2.1 g/L，相比于普通发酵而言下降了54.34%。

2.3 膜偶联发酵工艺对糖酸转化率的影响

采用膜偶联发酵工艺，发酵过程中的糖酸转化率如图5所示，一直维持在较高水平。在21 h开始透析后，由于抑制物质的解除和菌体生物量的增加，细胞合成色氨酸的速率得到提高，总的色氨酸的量也得到相应提高。在整个发酵过程中采用膜偶联发酵工艺，糖酸转化率为18.5%，而普通发酵的糖酸转化率为17.3%，相比而言糖酸转化率提高了6.9%。

2.4 膜过滤前后的代谢流量变化

图4 膜偶联发酵工艺对乙酸及谷氨酸积累量的影响

分别测定膜过滤前4 h即16～20 h（阶段1）与膜过滤后4 h即38～42 h（阶段2）内的葡萄糖消耗速率，以及胞外色氨酸、乳酸、乙酸、丙氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸的浓度，结果见表1。然后以葡萄糖摩尔消耗速率为100 mmol/（L·h），分别计算各自的消耗或积累速率。运用Metatool软件线性规划计算得到相应的代谢流分布，结果见表2。

色氨酸生物合成的前体物分别是磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和4-磷酸赤藓糖（E4P），大肠杆菌摄取葡萄糖后经糖酵解（EMP）途径与磷酸戊糖（HMP）途径生成PEP与E4P。色氨酸的合成有几个关键节点，如Glc6P节点和PEP节点。Glc6P节点主要控制着碳架形成X5P和E4P的多少，而PEP节点则决定着流向PEP与形成分支酸的代谢流量变化。由表2可知，在膜过滤之前（阶段1），有87.42%的碳架进入EMP（r2）途径，28%的碳架由F6P和GAP通过转酮酶催化生成X5P和E4P进入HMP途径（r16）。同时，流向分支酸的代谢流量为34.1%（r17）。而在膜过滤后（阶段2），有86.34%的碳架进入EMP（r2）途径，而27.3%的碳架由F6P和GAP通过转酮酶催化生成X5P和E4P进入HMP途径（r16）。流向分支酸的代谢流量为33.3%（r17）。膜过滤前后L-色氨酸的代谢流量分别为31%、30.2%。这表明采用膜偶联发酵工艺，膜过滤后与膜过滤前流向色氨酸的代谢流变化不大，细胞能保持较高的色氨酸生产速率。

图5 膜偶联发酵工艺对糖酸转化率的影响

表1 膜过滤前（阶段1）与膜过滤后（阶段2）物质浓度及其变化规律

表2 L-色氨酸生物合成代谢流分布

3 讨论

传统的发酵生产色氨酸的技术，不能解决发酵中后期乙酸积累的问题。采用膜偶联发酵工艺，可以解决底物与代谢副产物的抑制问题，提高目的产物的产量。目前，膜偶联发酵技术已经得到广泛应用[13]。例如在琥珀酸发酵生产过程中，发酵的同时采用外部纤维过滤器分离细胞，解决了产物琥珀酸的反馈抑制作用，得到了高细胞密度，并且提高了琥珀酸的产量[14]。

本实验采用膜偶联发酵工艺，在发酵罐内乙酸积累量达到抑制水平时开始透析，之后补加透析培养基继续进行发酵，可以显著降低发酵罐内乙酸与谷氨酸的积累量。采用膜偶联发酵工艺，整个发酵过程中流向色氨酸的代谢流一直保持在发酵中期较高水平，菌体生物量提高了3.4%，产酸周期延长了12 h，糖酸转化率提高了6.9%。本实验是在单一发酵罐中进行的，实际上可以连接二级、三级发酵罐，依次进行连续发酵，这有待于进一步的研究。

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Study on the L-Tryptophan Fermentation Progress Coupled with the Membrance Separation and Extraction Progress Technology

LIU Zhen-Yu,LIU Zi-Qiang,CAI Meng-Meng,CHEN Ning,XU Qing-Yang*
National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology;Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture;College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology;Tianjin 300457,China

Objective:To couple the fermentation process with the membrane separation and extraction process, so as to prolong the the whole L-tryptophan production period and reduce the accumulation of acetic acid and increase the production of target product and reduce the accumulation of the repressor.Methods:The membrane separation and extraction process was started when the amount of acetic acid reached 5 g/L and the fermentation time lastet for 21 h.The fermentation was continued when the dialysis medium was added.Results:With the application of membrane coupled fermentation technology,the biomass increased by 3.4%,and the accumulation of glutamic acid decreased by 54.34%,and the accumulation of acetic acid decreased by 55.36%.The whole acid production period extended 12 h,and the glucose conversion rate improved 6.9%.Conclusion:The application of membrane coupled fermentation technology can significantly increase the production of tryptophan and reduced the accumulation of the repressor.The whole L-tryptophan production period was prolongated,and the glucose conversion rate has improved.