胸腺素α1二聚体蛋白的初步毒理学研究

牛东，武都都，高凯丽，王昭维，张存，张英起，张伟，李维娜

1．肿瘤生物学国家重点实验室；

2.第四军医大学 a.药学系生物制药学教研室；b.学员一旅二营八连；陕西 西安 710032

胸腺素α1二聚体蛋白的初步毒理学研究

牛东1,2a,2b，武都都1,2a,2b，高凯丽1,2a，王昭维1,2a，张存1,2a，张英起1,2a，张伟1,2a，李维娜1,2a

1．肿瘤生物学国家重点实验室；

2.第四军医大学 a.药学系生物制药学教研室；b.学员一旅二营八连；陕西 西安 710032

目的：对胸腺素α1二聚体蛋白开展初步的毒理学研究，为后续系统地进行临床前研究提供依据。方法：将BALB/c小鼠随机分为生理盐水对照组和胸腺素α1二聚体蛋白高、中、低剂量组，观察胸腺素α1二聚体蛋白给药后小鼠的一般行为，进行血液生化学指征及组织病理学检测。结果：动物未见明显的中毒症状和死亡，与对照组相比，高、中、低各剂量胸腺素α1二聚体蛋白注射组的动物行为、活动、体重、进食量等与对照组无显著差异，血液生化指标与主要脏器组织形态学检查也均未见异常。结论：未发现胸腺素α1二聚体对小鼠有明显的毒性作用。

胸腺素α1；二聚体；毒理学；小鼠

胸腺素α1（thymosinα1，Tα1）是一种胸腺来源的酸性多肽，由28个氨基酸残基组成，是重要的生物调节剂，可以显著提高生物体的免疫应答能力[1]，临床上已广泛用于治疗各种原发性或继发性T细胞缺陷病、某些自身免疫性疾病、乙型肝炎、丙型肝炎以及辅助治疗肿瘤[2-6]。其临床疗效确切，毒副作用轻微，具有广阔的应用前景。

为克服市场上同类药品存在的纯度低、价格昂贵等问题，我们实验室前期构建和表达了Tα1二聚体（Tα1②）蛋白，实现了Tα1以二聚体的形式在大肠杆菌中高效表达，并用简便廉价的纯化工艺获得了高产量、高活性的纯化产物。细胞学实验证实Tα1②可以促进小鼠脾淋巴细胞的增值，具有比化学合成单体更高的生物学活性[7]。

为了进行系统的临床前研究，我们对Tα1②进行了初步毒理学检测。通过观察不同剂量Tα1②给药对小鼠的进食、体重等一般状况的影响，检测血清生化学指标、重要脏器相对重量、组织病理学情况，考察Tα1②的安全性，为进一步系统性进行Tα1②的临床前研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

BALB/c小鼠（雌性，16～18 g）购自第四军医大学实验动物中心；日达仙（SciClone公司）；IPTG（Solon公司）；4℃高速离心机、全自动生化分析仪（贝克曼公司）；HE染色试剂盒（博士德公司）。

1.2 小鼠的饲养与给药

BALB/c小鼠饲养环境为温度24～26℃，相对湿度40%～70%，自然通风，光照/黑暗各12 h，自由摄食、饮水。40只小鼠按体重随机分为生理盐水对照组及低浓度（80μg/只）、中浓度（160μg/只）、高浓度（320μg/只）Tα1②实验组，每组10只。分别于腹腔内注射生理盐水或Tα1②，每周2次，连续给药6周，给药后检测各项指标。

1.3 小鼠的一般情况

给药后每日观察小鼠一般状况，包括体貌、毛色、活动、摄食、饮水、对刺激的反应等。观察各组是否出现竖尾、躁动、惊厥等兴奋现象，或嗜睡、蜷缩、弓背等抑制现象。观察各组粪、尿情况，是否有腹泻、便血、黑便、尿血等现象，如有异常则进行记录。每周称取小鼠空腹体重并测定饲料消耗量1次，共计6周。

1.4 生化指标测定

小鼠最后一次给药次日摘眼球取血，取血前禁食过夜。血液静置30 min使其充分凝固，3000～4000 r/min离心分离血清，采用全自动生化分析仪进行血清生化学检测。

1.5 重要脏器形态学与组织学观察

迅速脱颈处死小鼠，进行系统解剖，观察各主要脏器形态大小差异，同时称重，与小鼠体重比较，求得各脏器系数（g/100 g）。摘取心、肝、肺、肾及脑新鲜组织，用多聚甲醛固定；固定后的组织经修块取材，常规石蜡包埋，滑动切片机5 μm切片；切片脱水脱蜡，苏木素-伊红（HE）染色，光镜下对各组织进行病理学检测。

1.6 统计学分析

采用SPSS17.0软件，组间t检验和单因素方差分析，计量结果以x±s表示，P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 小鼠的一般情况检测

高、中、低剂量Tα1②组及生理盐水对照组注射给药期间，各组动物一般状况良好，没有出现死亡；各组一般生理活动及二便未见异常；小鼠皮毛光泽，皮肤黏膜无异常，眼、耳、鼻、口及肛门等无异常分泌物；未见呼吸困难或呼吸频率、幅度等发生异常变化；摄食、饮水正常，未见呕吐、腹泻等胃肠道反应。

小鼠按体重随机分组，入组时各组体重无统计学差异。于给药第1、2、3、4、5、6周各称量体重一次，观察各组小鼠体重是否有变化，结果如表1及图1，各组小鼠体重呈缓慢上升趋势，给药组体重变化与对照组比较无显著性差异。

小鼠入组时各组摄食量无统计学差异。于给药第1、2、3、4、5、6周各计算摄食量一次，给药组与对照组比较无显著差异（表2、图2）。

表1 胸腺素α1二聚体对小鼠体重的影响（g，x±s，n=10）

2.2 血清生化学检测结果

给药6周后进行血清生化学分析，结果见表3。高剂量给药组总胆红素（TBIL）和血糖（GLU）水平与对照组比较略升高（P＜0.05），低剂量给药组的白蛋白（ALB）水平低于对照组（P＜0.01），但上述变化均在BALB/c小鼠的正常值范围内；其他各项血清生化指标与对照组比较无显著差异。

2.3 脏器组织病理学结果

解剖小鼠，肉眼观察各主要脏器均颜色鲜活，位置、大小无异常。称重并计算各脏器数（表4），给药组与对照组相比较无显著差异。各组织用多聚甲醛固定后，包埋蜡块切片进行HE染色（图3），各剂量组小鼠心、肝、肺、肾没有发现明显病变，与生理盐水对照组相比无差异。

3 讨论

作为一种重要的生物学应答调节物，Tα1对调节免疫功能、维持人体内动态免疫平衡具有重要作用。Tα1可以促进T细胞增殖及对抗原刺激的反应性[8]，增强T细胞介导同种或自身淋巴细胞反应的能力[9]，并且通过延迟自由基的产生和减少谷胱甘肽的消耗，拮抗淋巴细胞成熟过程中的凋亡[10]。Tα1能够活化巨噬细胞，促进其胞饮、胞吞及抗原提呈能力[11]。Tα1对树突状细胞（DCs）也具有促进成熟、分化的作用，能促使DCs分泌巨噬细胞激活因子从而增强机体免疫应答功能[12]。Ta1还有双向性免疫调节效应，具有保护免疫功能和调节神经内分泌细胞因子网络的作用，从而减轻细胞因子所致炎性损害，改善感染导致的高代谢状态[13]。

表2 胸腺素α1二聚体对小鼠摄食量的影响（g，x±s，n=10）

图1 小鼠给药期间的体重变化

图2 小鼠给药期间的摄食量变化

图3 各组小鼠重要脏器的HE染色图

表3 胸腺素α1二聚体对小鼠血清生化指标的影响（x±s，n=10）

Tα1已广泛应用于各种原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫病、病毒及微生物感染、肿瘤等的治疗中。单独应用或联合其他药物，临床疗效确切，不良反应极其轻微，且大剂量使用时无发热及过敏反应，有广阔的应用前景。但是，目前市售的Tα1多为化学合成或生物提取。前者制备成本高、售价昂贵，且生产工艺对环境有很大污染；后者从小牛等动物胸腺组织中提取获得，产量和纯度低，易引起患者的过敏反应。而Tα1序列过短，因此难于用基因工程方法直接获得。为解决这一难题，我们构建表达了有生物学活性的Tα1②，获得了高产量、低成本、高活性的纯化产物，具有比化学合成单体更高的生物学活性[7]。

我们以小鼠为试验对象，对Tα1②进行了初步毒理学研究，以评价其安全性。Tα1②给药后未引起动物死亡及出现明显的中毒症状，对小鼠的生长发育和血液生化指标等均没有不良影响。Tα1②给药后动物的行为、活动、体重、进食量等与对照组无显著差异。文献报道Tα1主要通过肾脏排泄[14]，实验结果显示与对照组相比，肾功能检测指标与肾脏外观大小、脏器系数及组织病理学等指标均未发现异常，其他主要脏器组织形态学检查也均未见异常。综上所述，未发现Tα 1②对小鼠有明显的毒性作用，为进一步系统性进行Tα1②的临床前研究提供了参考依据。

表4 胸腺素α1二聚体对小鼠脏器系数的影响（g/100g，x±s）

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Toxicity Study of Thymosinα1 Concatemer in BALB/c M ice

NIU Dong1,2,WU Du-Du1,2,GAO Kai-Li1,2,WANG Zhao-Wei1,2, ZHANG Cun1,2,ZHANG Ying-Qi1,2,ZHANG Wei1,2,LIWei-Na1,2*

1.State Key Laboratory of Cancer Biology;2.Department of Biopharmaceutics,School of Pharmacy,Fourth Military Medical University;Xi'an 710032,China

*Corresponding author,E-mail:liweina@fmmu.edu.cn

Objective:A primary safety study of recombinant human thymosinα1 concatemer protein was conducted to support the following design of preclinical trial.Methods:The BALB/c mice were injected intraperitoneally with saline or thymosinα1 concatemer protein.The parameters of standard toxicology were evaluated systematically.Results:Visible changes were not found on general signs,body weight,food consumption,clinical chemistry and necropsy analysis of main organ between thymosinα1 concatemer administrated group and normal saline control group.Conclusion:In conclusion,primary toxicology study showed that recombinant human thymosinα1 concatemer was well tolerated and had no significant adverse effect on mice.

thymosinα1;concatemer;toxicology;mice

R99

A

1009-0002（2017）03-0338-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.019

2017-01-06

国家自然科学基金（81301785，81472649，81672800）

牛东（1995-），男，本科生，（E-mail）88488031@qq.com

李维娜，（E-mail）liweina@fmmu.edu.cn