Q-PCR法检测腺病毒基因治疗产品中的复制型腺病毒

于雷，李永红，秦玺，杨靖清，饶春明

中国食品药品检定研究院，北京 100050

Q-PCR法检测腺病毒基因治疗产品中的复制型腺病毒

于雷，李永红，秦玺，杨靖清，饶春明

中国食品药品检定研究院，北京 100050

目的：建立Q-PCR法检测腺病毒基因治疗产品中的复制型腺病毒（RCA）。方法：首先制备高纯度的pXC1质粒参考品（含有E1基因序列），紫外吸收法定量后经过数学换算得到拷贝数；然后比较染料法和探针法的灵敏度，建立适用的Q-PCR检测方法；最后用新建Q-PCR法定量测定腺病毒基因治疗产品中的RCA。结果：pXC1质粒参考品的拷贝数初步标定为2.6×1010拷贝/μL；探针法的灵敏度比染料法高1000倍；将pXC1质粒参考品应用于Q-PCR（探针法）测定腺病毒基因治疗产品中的RCA，标准曲线回归方程为y=-1.416ln（x）+47.395，R2=0.9966，供试品的Cq值均位于标准曲线范围内。结论：新建Q-PCR法适用于检测腺病毒基因治疗产品中的RCA，且结果准确可靠。

腺病毒基因治疗产品；复制型腺病毒；Q-PCR；pXC1质粒

病毒载体类基因治疗产品除选择性复制的 溶瘤体病毒外，都是非复制型的，但是在病毒包装过程中，病毒基因组可能与包装细胞基因组经过同源重组产生复制型病毒。出于安全有效、质量可控的考虑，必须对该类病毒进行检测，以避免其在人体内无控地自我复制，造成伤害，规避临床隐患[1-4]。

腺病毒是目前基因治疗产品中最常用的病毒载体，其优点在于易操作且产量高。作为载体的腺病毒是经过改造的复制缺陷型，其复制必需基因E1区缺失，不能在除包装细胞系（293、911、PERC6等）以外的细胞中复制增殖[5-7]。腺病毒类基因治疗产品中复制型腺病毒（replication-competent adenoviruses，RCA）的测定主要采用细胞培养法和Q-PCR法[8-14]。细胞培养法是首先将产品感染腺病毒载体毒性耐受的细胞株（如HeLa），用上清在A549细胞中连续传代并检测细胞病变数。该法的缺点是高滴度的腺病毒对细胞有毒性，可能会阻碍RCA的复制，造成假阴性，因此须感染大量细胞，且实验周期长，需数周时间。Q-PCR法则针对E1区序列设计引物，绘制标准曲线，对RCA予以定量。但Q-PCR不能绝对定量，需要依赖标准品进行相对定量。本研究拟制备E1模板参考品，建立Q-PCR法定量测定腺病毒基因治疗产品中的RCA。我们选择含有E1基因的pXC1质粒来制备模板标准品，首先制备高纯度的pXC1质粒参考品，紫外吸收法定量后经过数学换算得到拷贝数；然后比较染料法和探针法的灵敏度，建立合适的Q-PCR检测方法；最后将pXC1质粒参考品用于Q-PCR定量测定腺病毒基因治疗产品中的RCA。

1 材料与方法

1.1 材料

pXC1质粒购自Biovector公司；高纯度质粒DNA提取试剂盒购自Invitrogen公司；病毒基因组DNA提取试剂盒购自Solarbio公司；Power SYBR Green PCR Master Mix、Luminaris Color Probe qPCR Master Mix购自Thermo Fisher公司；荧光定量PCR仪为Thermo Fisher公司产品。

染料法引物up（5'-GGGTCCGGTTTCTATGCC AA-3'）、down（5'-CCGTATTCCTCCGGTGATAATG-3'），探针法引物1035F（5'-TCCGGTCCTTCTAAC ACACCTC-3'）、1105R（5'-ACGGCAACTGGTTTAA TGGG-3'），探针TGAGATACACCCGGTGGTCCCGC（5-FAM，3-BHQ1）均由六合通公司合成。腺病毒基因治疗样品P53、内皮抑素（endo）、IFN-γ和葡萄糖激酶（GCK）由本科室留存。

1.2 质粒参考品的制备

pXC1质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选单克隆，DNA测序验证，取生长过夜的菌液，用高纯度质粒提取试剂盒提取质粒，紫外吸收法测定浓度。

1.3 染料法

PCR体系（10μL）：上、下游引物（5μmol/L）各1μL，2×Power SYBR Green PCR Master Mix 5μL，模板2μL，去离子水1μL。PCR程序：95℃ 10 min；50个循环（95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s）。

1.4 探针法

PCR体系（10μL）：上下游引物（5μmol/L）各1μL，探针（1.6μmol/L）1μL，2×Luminaris Color Probe qPCR Master Mix 5μL，模板2μL。PCR程序：50℃ 2 min，95℃ 10 min；50个循环（95℃ 15 s，60℃ 10 min）。

1.5 病毒基因组DNA的提取

参照试剂盒说明书进行，所有操作在生物安全柜中进行。

2 结果

2.1 pXC1质粒参考品的制备和初步标定

pXC1质粒测序验证与理论序列完全一致。将提取的pXC1质粒用去离子水稀释至1/50，测定D260nm、D280nm值，计算DNA浓度，结果见表1。经过换算，得到该pXC1质粒参考品的拷贝数为2.6×1010拷贝/μL。

表1 紫外吸收法测定结果及计算

2.2 染料法和探针法比较

用染料法和探针法对pXC1质粒参考品进行检测，结果见表2。探针法的最低检测限为52.0拷贝/μL，而探针法的最低检测限仅为5.20×104拷贝/μL，前者的灵敏度比后者高1000倍。因此，选用探针法检测腺病毒基因治疗产品中的RCA。

2.3 腺病毒基因治疗产品中RCA的测定

用pXC1质粒参考作为标准品绘制标准曲线，对腺病毒基因治疗产品进行RCA测定。首先将pXC1质粒分别稀释至2.6×102、2.6×103、2.6× 104、2.6×105、2.6×106、2.6×107拷贝/μL，将检测结果绘制标准曲线，得到线性回归方程y=-1.416ln（x）+47.395，R2=0.9966。图1A为标准品和供试品的扩增曲线，图1B为标准曲线。将几种待测腺病毒基因治疗样品P53、内皮抑素、IFN-γ和葡萄糖激酶测得的Cq值带入公式，计算样品中RCA的拷贝数，结果见表3。

表2 染料法和探针法检测结果

3 讨论

Q-PCR法的灵敏度理论上可以达到单拷贝，但是我们实验中的检测限仅为52.0拷贝，分析原因可能有以下两个方面：①质粒的纯度，由于质粒提取以后没有经过进一步的纯化，里面可能混杂着大量基因组DNA碎片，使紫外吸收法所测数值偏高，实际拷贝数比计算得到的拷贝数要低；②质粒的空间结构，大部分质粒是紧密折叠的，使模板序列未能充分暴露，PCR不完全。所以，要制备E1DNA标准品，需要纯度更高的线性DNA序列。我们目前正在研究使用纯化的PCR扩增产物作为模板，即设计引物PCR扩出高特异性的E1基因DNA片段，然后选择电泳回收或HPLC进行纯化，获得高纯度的模板标准品。对模板标准品拷贝数的标定，考虑使用更加准确的液滴式数字PCR替代现有的紫外吸收法。

表3 腺病毒基因治疗产品中RCA测定结果

图1 标准曲线法检测腺病毒基因治疗产品中的RCA

从腺病毒基因治疗产品的检测结果来看，几种样品的Cq值均位于标准曲线内，说明该法是适用的，且结果可靠。AD-P53-01和AD-P53-02为同一厂家不同批次的产品，结果相近。AD-GCK-1、AD-GCK-2和AD-GCK-3为同一样品，ADGCK-1病毒基因组DNA的提取在生物安全柜中进行，而AD-GCK-2和AD-GCK-3在普通实验室环境中进行，后者测得结果高出前者数百倍，考虑是被环境中野生型腺病毒污染，因此该操作必须在生物安全柜中进行，所用试剂和耗材也必须是无腺病毒污染的，以避免假阳性结果出现。

Q-PCR所测定的是E1基因序列，供试品可能由于生产工艺等问题存在残留的含有E1基因序列的包装细胞DNA碎片，如果仅依赖Q-PCR方法可能造成假阳性结果。目前有报道使用感染性PCR法来测定复制型腺病毒，该方法将细胞法和Q-PCR法相结合，先将供试品用细胞法培养一段时间使RCA得到扩增，再用Q-PCR法进行检测，此法在缩短了实验周期的同时还增加了灵敏度。但是，任何依赖于Q-PCR的方法都需要准确可靠的标准品。因此我们下一步的计划是以纯化的PCR扩增产物DNA片段作为模板，并使用数字定量PCR方法进行标定，建立更加准确可靠的参考品，用于Q-PCR法定量检测基因治疗产品中的RCA。目前美国FDA建议的RCA限量为＜1个RCA/3×1010病毒颗粒，国内相关标准还不完善，需要充分考察相关产品后制定合适的标准。QPCR定量检测RCA方法的建立，有助于相关标准的确立，对腺病毒基因治疗产品的安全性和生产工艺稳定性评价具有重要意义。

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Detection of Rep lication-Competent Adenoviruses in Adenoviral Gene Therapy Products by Q-PCR

YU Lei,LI Yong-Hong,QIN Xi,YANG Jing-Qing,RAO Chun-Ming*

National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050,China

*Corresponding author,E-mail:raocm@nifdc.org.cn

Objective:To develop a Q-PCR method to detect replication-competent adenoviruses（RCA）in adenoviral gene therapy products.Methods:Highly purified pXC1 plasmid（containingE1gene）reference was prepared, the potency was determined by UV method,and the copy number was calculated by mathematical transformation. The sensitivity of SYBR Green method and probe method were compared to determine the appropriate Q-PCR. RCA in adenoviral gene therapy products were detected by newly established Q-PCR method.Results:The copy number of pXC1 plasmid reference was preliminarily calibrated to be 2.6×1010copies perμL;the sensitivity of probe method was 1000 times higher than SYBR Green method.pXC1 plasmid reference was applied to detect RCA in adenoviral gene therapy products by Q-PCR,the regression equation wasy=-1.416ln（x）+47.395,R2= 0.9966,and the Cq values of test samples were located within the scope of standard curve.Conclusion:The developed Q-PCR with high sensitivity is suitable to detect RCA in adenoviral gene therapy products,and its accuracy and reliability are validated.

adenoviral gene therapy products;replication-competent adenoviruses（RCA）;Q-PCR;pXC1 plasmid

Q78

A

1009-0002（2017）03-0352-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.022

2017-04-20

于雷（1984-），女，助理研究员，（E-mail）yulei@nifdc.org.cn；李永红（1972-），男，研究员，（E-mail）liyh@nifdc.org.cn；并列第一作者

饶春明，（E-mail）raocm@nifdc.org.cn