K-ras原核表达载体的构建及生物学功能研究

陈思禹,崔越,洪甜,李玲,晋帅,黄俊,尤文叶,韩笑,叶棋浓,刘阳,王钰琦

1.解放军总医院，北京 100853；2.首都师范大学，北京 100048；

3.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850；4.锦州医科大学，辽宁 锦州 121000

K-ras原核表达载体的构建及生物学功能研究

陈思禹1,崔越2,洪甜3,李玲3,晋帅1,黄俊3,尤文叶1,韩笑4,叶棋浓2,刘阳1,王钰琦1

1.解放军总医院，北京 100853；2.首都师范大学，北京 100048；

3.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850；4.锦州医科大学，辽宁 锦州 121000

目的：构建带Myc标签的K-ras原核表达载体，并初步鉴定其生物学活性。方法：利用PCR技术从人乳腺文库中扩增人K-ras结构域的基因编码序列，插入载体pXJ-40得到重组质粒，经BamHⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定后，Western印迹检测其在人293T细胞中的表达；利用GST pull down实验检测与Raf1-RBD的结合情况，验证其生物性活性。结果：用PCR技术从人乳腺文库中扩增得到约570 bp的目的片段，插入载体pXJ-40后构建了Myc-K-ras重组质粒，并经酶切鉴定及测序证实无误；Myc-K-ras能在293T细胞中正确表达，并能与Raf1-RBD结合，具有生物学活性。结论：为进一步研究K-ras的生物学功能奠定了重要基础。

人K-ras基因；Ras/Raf/Mek/Erk；原核表达

［Key words］humanK-rasgene;Ras/Raf/Mek/Erk;eukaryotic expression

RAS通路作为调节表皮生长因子受体活化下游效应的主要信号转导通路之一，对细胞的增殖具有非常重要的作用[1]。RAS家族包括K-ras/N-ras/H-ras，它们具有相似的结构与功能。RAS蛋白相对分子质量为21×103，因而又称P21蛋白。RAS蛋白具有GTP酶活性作用，通过将有丝分裂和生长信号从细胞浆传递到细胞核内而参与调节细胞的生长、增殖、分化和调亡等多种生物学过程[2]。

大量研究显示肺癌的发生与K-ras突变密切相关。15%～20%的非小细胞型肺癌（NSCLC）患者存在ras基因突变，其中约90%为K-ras基因突变；约80%的K-ras基因突变发生于12号密码子（G12D），其余则主要位于13和61号密码子上[3]。现已发现约30%的肺腺癌患者有K-ras基因突变，且K-ras基因突变多见于女性患者。在早期和局部晚期NSCLC中，K-ras基因突变与生存期短有密切关系，K-ras基因突变预示预后不良[4～5]。

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌DH5α感受态、原核表达载体pXJ-40、结合有GST蛋白的GST beads、结合有GSTRaf1-RBD蛋白的GST beads由本实验室保存；限制性核酸内切酶BamHⅠ和KpnⅠ、PCR所需试剂及T4DNA连接酶由TaKaRa公司提供；合成K-ras基因片段的上、下游引物由作者设计，北京赛百盛生物技术有限公司合成；DNA胶回收试剂盒购自北京天根生物科技有限公司；质粒提取试剂盒为Promega公司产品；DMEM及小牛血清均购自Gibco公司；VigoFect为威格拉斯生物技术有限公司产品；辣根过氧化物酶（HRP）偶联的抗Myc标签鼠单克隆抗体由Sigma公司提供；已构建的基因由北京华大生物技术有限责任公司测序。

1.2 人K-ras基因编码区的扩增

根据文献报道的K-ras基因编码序列设计上、下游引物。扩增模板为人乳腺文库，扩增目的基因片段过程中使用Prime star酶。PCR条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸1 min，34个循环；72℃再延长5 min。PCR结束后检测PCR产物，在紫外灯下鉴定后切出目的基因片段，用DNA胶回收试剂盒完整地回收目的基因片段。

1.3 Myc-K-ras重组质粒的构建及鉴定

PCR产物及载体pXJ-40经BamHⅠ和KpnⅠ双酶切，用T4DNA连接酶于16℃连接过夜后转化大肠杆菌DH5α，挑单克隆进行菌液PCR鉴定及BamHⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定，将阳性单克隆的质粒送北京华大公司测序。

1.4 Myc-K-ras在293T细胞系中的表达

将质粒Myc、Myc-K-ras各转染2个10 cm皿，每皿转染15μg，24 h后收细胞，用含1∶1000的蛋白酶抑制剂和DTT的RIPA裂解液混匀细胞，冰浴30 min后加入等量的SDS，用Western印迹检测其表达情况。

1.5 Myc-K-ras活性检测

Myc-K-ras转染10 cm皿，15μg质粒，24 h后收细胞，用含1∶1000的蛋白酶抑制剂和DTT的低盐免疫沉淀（IP）缓冲液500μL混匀细胞，冰浴30 min后超声波裂解细胞（超声2 s，停2 s，每个样品超声2次），之后于4℃、12 000 r/min离心10 min，取离心后的30μL细胞超声波产物于另一管中做in put，加入等量的SDS于-20℃保存。将与GST-Raf1-RBD结合的beads、与GST结合的beads各30μL分别加入上述细胞裂解产物中，于4℃结合4 h以上，4℃、3000 r/min离心3 min去上清，用IP缓冲液500μL洗3次，混匀，于4℃环境中摇晃，5 min后，3000 r/min离心2 min重复3次，利用Western印迹检测观察活性。

2 结果

2.1 人K-ras基因编码序列的克隆

扩增模板为人乳腺文库，扩增获得与预期片段大小（约570 bp）一致的PCR产物（图1）。

2.2 重组质粒的构建及鉴定

用BamHⅠ和KpnⅠ同时对目的基因片段及pXJ-40载体进行双酶切，之后将二者连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，做菌液PCR后挑选阳性克隆（图2），提取相应的质粒，对质粒进行BamHⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定，可见约570 bp的目的条带（图3），表明人K-ras基因的编码序列已插入载体pXJ-40相应的酶切位点中。将连接成功的质粒送北京华大生物技术有限责任公司测序，测序后的目的片段与文献报道相应序列进行比对，结果表明两者完全一致（序列略），无任何突变现象发生。

2.3 Western印迹检测Myc-K-ras在293T细胞中的表达

为了验证Myc-K-ras能否在细胞中正确表达，将构建初步成功的Myc-K-ras质粒和Myc空载体分别转染293T细胞，24 h后收集细胞蛋白进行Western印迹。结果显示，转染Myc空载体的无条带，转染Myc-K-ras质粒的在相对分子质量约21×103处检出条带（图4），说明构建的Myc-K-ras能在293T细胞中正确表达。

图1 目的基因K-ras的PCR扩增

图2 重组质粒Myc-K-ras的菌液PCR鉴定

图3 重组质粒Myc-K-ras的酶切鉴定

2.4 Myc-K-ras活性鉴定

用纯化的GST-Raf1-RBD融合蛋白、GST蛋白与转染Myc-K-ras的细胞裂解产物的GST-pull down反应结果进行Western印迹，结果显示Myc-K-ras可与GST-Raf1-RBD蛋白结合，与文献报道一致（图5）[6～7]。

图4 Western印迹检测Myc-K-ras的表达

图5 Myc-K-ras活性鉴定

3 讨论

发现非小细胞肺癌K-ras基因突变已有20多年，其临床价值最近引起广泛关注。最近的研究显示[8-9]，存在K-ras基因突变的非小细胞肺癌患者难以从辅助化疗中获益，而且K-ras基因突变多发生于应用Gefitinib或Eroltinib治疗过程中疾病进展的NSCLC患者[10]。有研究表明，存在K-ras基因突变的NSCLC患者在应用Eroltinib联合化疗时，其疾病进展时间及中位生存时间均低于单独应用化疗的患者[11]。这些提示K-ras基因突变情况可作为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂疗效的预测指标。此外，关于K-ras基因突变与吸烟史之间的关系众说纷纭，有研究显示K-ras基因突变与吸烟史密切相关，而在终生未吸烟患者中几乎未发现K-ras基因突变[12]，但亦有研究显示不吸烟的NSCLC患者同样可存在K-ras基因突变[13]。可见关于K-ras与肺癌发生的关系有大量工作亟待解决。因此，Myc-K-ras的构建对研究K-ras突变与肺癌发生之间的关系有重要意义。

参考文献

[1]Downward J.Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy[J].Nat Rev Cancer,2003,3(1):11-22.

[2]Khosravi-Far R,Der C J.The Ras signal transduction pathway[J].Cancer Metastasis Rev,1994,13(1):67-89.

[3]Mascaux C,Iannino N,Martin B,et al.The role of RAS oncogene in survival of patients with lung cancer:a systematic review of the literature with meta analysis[J].Br J Cancer,2005,92(1):131-139.

[4]Nelson H H,Christiani D C,Mark E J,et al.Implications and prognostic value of k-ras mutation for earlystage lung cancer in women[J].J Natl Cancer Inst, 1999,91(23):2032-2038.

[5]Huncharek M,Muscat J,Geschwind J F.K-ras oncogene mutation as a prognosticmarker in non-small cell lung cancer:A combined analysis of 881 cases [J].Carcinogenesis,1999,20(8):1507-1510.

[6]Mclubrey J A,Steelman L S,Chappell W H,et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant t ransformat ion and drug resistance[J].Biochim Biophys Acta,2007,1773(8):1263-1284.

[7]Sacks D B.The role of scaf fold proteins in MEK/ ERK signaling[J].Biochem Soc Trans,2006,34(5):833-836.

[8]Tsao M S,Aviel-Ronen S,Ding K,et al.Prognostic and predictive importance of p53 and ras for adjuvant chemotherapy in non-small cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2007,25(33):5240-5247.

[9]Winton T,Livingston R,Johnson D,et al.Vinorelbine plus cisplatin vs.observation in resected non-smallcell lung cancer[J].N Engl J Med,2005,352(25):2589-2597.

[10]Pao W,Wang T Y,Riely G J,et al.KRAS mutations and primary resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib[J].PLoS Med,2005,2(1):e17.

[11]Eberhard D A,Johnson B E,Am ler L C,et al.Mutations in the epidermalgrowth factor receptor and K-ras are predictive and prognostic indicators innonsmall cell lung cancers treated with chemotherapy alone and in combinationwith erlotinib[J].J Clin Oncol,2005,23(25):5900-5909.

[12]Ahrendt S A,Decker P A,Alawi E A,et al.Cigarette smoking is strongly associated with mutation of the K-ras gene in patients with primary adenocarcinoma of the lung[J].Cancer,2001,92(6):1525-1530.

[13]Riely G J,Kris M G,Rosenbaum D,et al.Frequency and distinctive spectrumof KRAS mutations in never smokers with lung adenocarcinoma[J].Clin Cancer Res,2008,14(18):5731-5734.

Construction of Hum an K-ras Eukaryotic Expression Vector and its Biological Function Research

CHEN Si-Yu1,CUI Yue2,HONG Tian3,LI Ling3,JIN Shuai1,HUANG Jun3, YOU Wen-Ye1,HAN Xiao4,YE Qi-Nong2*,LIU Yang1*,WANG Yu-Qi1*

1.PLA General Hospital,Beijing 100853;2.Capital Normal University,Beijing 100048;3.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;4.Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000;China

*Co-corresponding authors,WANG Yu-Qi,E-mail:wyq301@qq.com;LIU Yang,E-mail:sunny301x@sina.com;YE Qi-Nong,E-mail:yeqn66@yahoo.com

Objective:To construct the eukaryotic expression vector of humanK-raslabeled with Myc tag and preliminary detect the biological function of the expression product Myc-K-ras.Methods:HumanK-rasgene was obtained from human mammary gland cDNA library by PCR and cloned into pXJ-40 vector.After the eukaryotic expression vector mediated expression of Myc-K-ras was observed in the human kidney 293T cells lines.The interactions of the K-ras with Raf1-RBD were identified by GST-pull-down assay.Results:The DNA fragment of about 570 bp was amplified from human mammary gland cDNA library by PCR,K-raseukaryotic expression vector labeled with Myc was constructed and the expression of human K-ras protein was detected by Western blot in the human kidney 293T cells lines.Myc-K-ras fusion protein of about 21 kD was induced and identified by SDSPAGE analysis,its activity was consistent with the report.Conclusion:The results has laid foundation for the further study on the function ofK-ras.

Q78

A

1009-0002（2017）03-0324-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.016

2016-12-13

国家自然科学基金（81472589，31100604）

陈思禹（1991-），男，硕士研究生，（E-mail）15608407432@163.com；崔越（1991-），男，本科生，（E-mail）1091279576@qq.com；二者为共同第一作者

王钰琦，（E-mail）wyq301@qq.com；刘阳，（E-mail）sunny301x@sina.com；叶棋浓，（E-mail）yeqn66@yahoo.com