荧光-磁共振双功能纳米探针标记乳腺癌细胞

章娉 唐焱 周佳 蒋迪 刘红雨

南华大学附属第一医院超声科 衡阳 421001

荧光-磁共振双功能纳米探针标记乳腺癌细胞

章娉 唐焱 周佳 蒋迪 刘红雨

南华大学附属第一医院超声科 衡阳 421001

目的 探讨载Herceptin靶向聚乳酸-羟基乙酸[poly(1actic-co-glycolic acid)，PLGA]-超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide，SPIO)分子探针的构建方法及对乳腺癌体外靶向结合的可行性。方法 以 PEG 化端羧基 PLGA 作为成膜材料，采用双乳化法及碳二亚胺化学连接法，制备装载超顺磁性氧化铁的 Herceptin-SPIO-PLGA探针，并对其粒径、表面形态等进行检测，体外培养高表达 HER2 的乳腺癌细胞株SK-BR-3，评价其体外寻靶能力及MTT法检测所制备探针对细胞活性的影响。结果 光镜及扫描电镜观察所制备探针形态规则，呈球形，表面光滑，分散性好，大小较均匀，粒径为(281.5±81.2)nm。透射电镜结果显示探针为壳核结构，USPIO分布于壳膜中，且其分布具有随机性。Herceptin-SPIO-PLGA即使在Fe 浓度达到400 μg/mL，细胞存活率仍保持在90%以上，具有较低细胞毒性。在激光扫描共聚焦显微镜下，被SK-BR-3细胞吞噬的发出红色荧光。结论 双靶点磁性、荧光双模态分子探针多肽Herceptin-SPIO-PLGA具有优良的理化性质及稳定性，生物安全性好，肿瘤靶向结合能力强。

分子探针；磁共振成像；乳腺肿瘤

随着医学分子显像技术的迅猛发展，单一成像模式与诊断功能的显影剂已远远不能满足日益增长的医学多样化和个性化需求。多功能显像剂集合超声、磁共振、光学等两种或多种成像技术优势，能在解剖、功能及分子水平对病变细胞发生、发展与凋亡进行多种模式显示，为临床提供更加完整而准确的生物信息[1]。我们通过制备肿瘤双靶点磁性、荧光双模态分子探针，评价其理化性质，并以乳腺癌细胞为模型，初步探讨该探针对乳腺癌行 MRI、光学双模态分子成像的可行性。

1 资料与方法

1.1 试剂与仪器 (1)有机溶剂(上海化工厂)，MTT试剂盒(美国Sigma公司)，胎牛血清和DAPI(美国Invitrogen)，细胞培养基(美国Gibco)，DiI 细胞膜红色荧光探针及DiO 细胞膜绿色荧光探针(武汉博士德生物有限公司)，乳腺癌细胞株(SK-BR-3)由上海中科院细胞库提供。(2)主要仪器 CO2培养箱，离心机(上海仪器设备厂)，倒置显微镜，透射显微镜，扫描电镜(日本Olympus)，流式细胞仪(美国BD公司)，3.0 T MR仪(美国GE公司)，激光共聚焦显微镜(日本Olympus)。

1.2 分析方法 (1) 荧光-磁共振双功能分子探针的构建及表征分析：采用双乳化法制备：将一定比例的 PLGA-COOH 与 SPIO溶于三氯甲烷中至充分溶解；向上述溶液中加入适量 PFP，冰浴条件下应用声振仪振荡。取适量 5% PVA 液加入上述乳化液中，高速分散均质机均质。加入 2%异丙醇，冰浴条件下旋转蒸发 1～2 h。双蒸水洗涤、离心、收集，即得到多功能显像剂。(2) DiI 标记的携 Herceptin 的多功能分子探针的制备。采用碳二亚胺法将制得的载 SPIO 多功能显像剂复溶于10 mL MES 缓冲液(0.1 mol/L,pH=5)中。先后向其中加入过量的 EDC及 NHS(物质的量比为 1.5∶1)，置于摇床上，4 ℃下活化 2 h 后用双蒸水洗涤离心 3 次。将活化的显像剂复溶于 10 mL MES 缓冲液(0.1 mol/L，pH=8)中，向其中加入适量 DiI 荧光标记的 Herceptin，4 ℃下反应 1 h 后，用双蒸水洗涤离心 3 次以去除未反应的Herceptin，收集得到携 Herceptin 的多功能分子探针(Herceptin-PLGA-SPIO)。采用光学显微镜及扫描电镜观察多功能分子探针表面形态。(3) 细胞寻靶实验：人乳腺癌SK-BR-3细胞用含10%胎牛血清的 PRMI-1640培养液，于 37 ℃、5% CO2条件下常规培养。将SK-BR-3随机分为3组：靶向显像剂(多功能分子探针)组、非靶向组和空白对照组，分别加入靶向显影剂、非靶向显影剂以及 PBS 液。37℃ 孵育 2 h 后，用 PBS 洗涤 3 次，再用 Hoechst 蓝色荧光染料标记细胞核，在激光共聚焦显微镜下观察各组试剂与细胞的结合情况。(4) 细胞毒性实验：多功能探针取9个浓度梯度，分别是400、200、100、50、25、12.5、6.3、3.2、1.6 μg/mL，孵育24 h后，加入MTT(5 mg/mL)。4h后除去培养基和材料混合物，加入DMSO，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

2 结果

2.1 双模态分子探针的构建及表征 本实验所制备的多功能分子探针呈棕褐色粉末状，以去离子水复溶后，溶解性好，呈棕黄色乳液，样品随铁含量的增加颜色逐渐加深。扫描电镜下观察见颗粒形态规则呈球形，大小均匀一致，粒径为(281.5±81.2)nm，分散度好，球面欠光滑。透射电镜见颗粒呈球形，可见外壳中USPIO 分布于其中(见图1)。

A颗粒形态规则呈球形，大小均匀一致，分散度好 B扫描电镜观察见球面欠光滑 C透射电镜见颗粒呈球形，外壳中USPIO 分布于其中

图1 扫描电镜及透射电镜下观察

2.2 细胞毒性实验情况 多功能分子探针对SK-BR-3细胞的毒性 SK-BR-3 细胞与不同浓度分子探针孵育24 h后，细胞的活性分别为 (99.83±15.37)、(99.51±10.17)、(99.35±9.84)、(95.91±10.25)、(95.66±8.61)、(92.65±3.05)、(90.08±1.96)、(90.10±1.35)，这表明分子探针对SK-BR-3 细胞毒性很小。

2.3 细胞寻靶实验情况 细胞膜绿色荧光探针DiO可将乳腺癌细胞膜标记为绿色荧光，且 DiO 不会影响细胞的生存活性，DiI 标记的探针呈红色荧光。不同处理组的细胞周围所结合的荧光探针有很大的差异。空白对照组的细胞周围几乎无红色的荧光，非靶向组的细胞周围可见少量红色荧光，而靶向探针组可观察到细胞膜周围大量的红色荧光。说明该靶向探针具有独特主动靶向 HER-2 受体阳性表达乳腺癌细胞的能力。见图2。

图2 细胞寻靶结合实验

3 讨论

乳腺癌(breast cancer)是女性最常见的恶性肿瘤之一，通常发生在乳腺上皮组织，发病率占全身各种恶性肿瘤的 7%～10%，已成为威胁妇女健康的主要病因，严重影响妇女身心健康甚至危及生命。临床发现，大约40%的乳腺癌患者表达人表皮生长因子受体-2(HER2)，HER2 阳性的肿瘤恶性程度高，进展快，更容易复发和转移，且预后不佳，是“最凶险的乳腺癌”[2-3]。

近年来纳米技术靶向药物传递技术成为当前研究的热点。纳米粒经表面修饰可连接抗体、多肽、适配子等而具有靶向性，再装载携带对比显像剂及药物或基因后，不但可实现肿瘤分子显像，从分子及细胞水平显示肿瘤发生、发展与转归过程，并可定向传递药物，发挥靶向治疗作用，实现影像学方法实时监控下的靶向治疗与疗效评估，形成一种集肿瘤早期诊断、可视化靶向治疗与疗效评估为一体的全新生物医学模式和医学基础研究平台技术[4]。近年来，国外、国内很多学者致力于多功能显影剂的制备与应用研究，取得了一定成果。Xu H[5]等融合纳米金壳与 PFOB 材料制备了可同时增强体外及体内超声、CT 成像，并对裸鼠移植瘤具有光热治疗作用的多功能纳米囊。国内学者已经完成制备了载氧化铁纳米颗粒的多功能显像剂，该多功能显像剂能同时增强超声及磁共振成像，对高强度聚焦超声消融兔乳腺移植瘤亦有增强作用[6]。对多功能显像剂中包载抗肿瘤药物，还能进一步发挥抗肿瘤效应，是一种优良的多功能显像剂，为肿瘤的诊断与治疗研究提供了新思路与新途径。但目前多功能显像剂的研究中也存在一些问题，如制备多功能显像剂的功能性核心材料选择与多种影像技术的匹配，体内高效分子成像与治疗功能的有机结合等。

超顺磁性氧化铁(superparamagnetici ron oxide, SPIO)纳米颗粒是一种备受关注的新型磁性纳米生物材料。其粒径小、表面可修饰性强，超顺磁性强、灵敏度高、靶向性好，毒性低、生物安全性好、体内半衰期较长，在生物检测、疾病诊断及治疗等方面均展现了巨大的应用价值[7-9]。SPIO在磁共振成像方面的应用，已得到全世界范围的广泛关注。乳腺癌分子靶向治疗药物Herceptin能与HER2受体的膜外段高效、特异性结合，最后用高分子复合物[10]。Herceptin-PLGA-SPIO可以实现对HER2高表达人乳腺癌SK-BR-3细胞靶向标记与成像。

随着医学的发展以及人们对生活质量和形体美容需求的增强，肿瘤的无创治疗已成为发展趋势，尤其是乳腺肿瘤的保乳治疗越来越受到重视。结合功能颗粒 SPIO 及温敏材料 PFP 的多功能分子探针，充分发挥了磁热疗、磁致相变及生物分子治疗作用，能有效杀灭乳腺癌，同时还能在体内实时动态地监测治疗效果。我们采用双乳化法及碳二亚胺共价连接法，成功制备了Herceptin-PLGA-SPIO，其粒径只有10 nm，在透射电镜下观察，SPIO 呈颗粒状，随机镶嵌于高分子壳结构中。同时我们还观察了Herceptin-PLGA-SPIO在体外与SK-BR-3细胞的靶向结合能力。结果非靶向组的细胞周围可见少量红色荧光，而靶向探针组可观察到细胞膜周围大量的红色荧光，说明该靶向探针具有独特主动靶向 HER2 受体阳性表达乳腺癌细胞的能力，与其他文献的结果一致[11-13]。不同浓度的分子探针与 SK-BR-3 细胞共孵育后，细胞的增值活性均在90%以上，对其无明显影响。进一步说明分子探针的生物安全性。本实验存在不足之处为：未在裸鼠乳腺癌模型上进一步评价多功能分子探针磁共振、光声学效果，需在后续实验中进一步深入研究。

总之，我们制备的荧光-磁共振双功能纳米探针具有良好的生物学特性，针对乳腺癌HER2良好的靶向成像效果，为下一步进行体内成像研究奠定了基础。

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(收稿 2016-12-09)

Synthesis of a novel long-circulating dual-receptor targeting and dual-modal molecular probe: an in-vitro study

ZhangPing，TangYan,ZhouJia,JiangDi,LiuHongyu.
DepartmentofultrasoundDiagnosisoftheFirstAffiliatedHospitalofUniversityofNanhua，HengyangHunan, 421001,China

Objective To explore a novel long-circulating dual-receptor targeting and dual-modal molecular probe and investigate its physicochemical properties and targeting effect on breast cancer cells in vitro. Methods Herceptin-SPIO-PLGA was prepared by double emulsion and a carbodiimide technique, with different concentration of SPIO input in the oil phase to synthesize with various SPIO-loaded.The morphology of the Herceptin-SPIO-PLGA was observed by the light microscope (LM), scanning electron microscope(SEM) and transmission electron microscope (TEM). The mean size and size distribution were measured by a laser instrument.The cytotoxicity of Herceptin-SPIO-PLGA on the SK-BR-3 cells was detected by MTT assay. Results The prepared Herceptin-SPIO-PLGA was well dispersed, uniform and spherical. The size of the Herceptin-SPIO-PLGA was(281.5±81.2)nm.There was low cytotoxity of the molecular probe on human umbilical vein endothelical cells(SK-BR-3) by MTS study.Herceptin-SPIO-PLGA internalized by SK-BR-3 cells exhibited red fluorescence under confocal laser scanning microscope. Conclusion Herceptin-SPIO-PLGA is a novel long-circulating dual-receptor targeting and dual-modal molecular probe and has excellent physicochemical properties and stability and strong targeting effect on cancer cells and has laid a solid foundation for early diagnosis of breast cancer.

Molecular probes；Magnetic resonance imaging；Breast neoplasms

R737.9

B

1077-8991(2017)03-0002-04