香延止痛方对寒凝血瘀证原发性痛经大鼠的治疗效果及其作用机制

曹卫平，马青，师伟，刘少玲，李霞，王东梅

(1 山东中医药大学第一临床医学院，济南250014；2 山东中医药大学附属医院；3 烟台市中医医院；4 山东省医学科学院基础医学研究所)

香延止痛方对寒凝血瘀证原发性痛经大鼠的治疗效果及其作用机制

曹卫平1，2，马青1，师伟2，刘少玲3，李霞4，王东梅2

(1 山东中医药大学第一临床医学院，济南250014；2 山东中医药大学附属医院；3 烟台市中医医院；4 山东省医学科学院基础医学研究所)

目的 探讨香延止痛方对寒凝血瘀证原发性痛经大鼠的治疗效果及其作用机制。方法 选择大鼠50只，随机分为空白组、模型组、西药组及中药低、高剂量组，模型组、西药组及中药低、高剂量组建立寒凝血瘀证原发性痛经模型，造模第7天，空白组和模型组予蒸馏水2 mL/只灌胃，西药组予布洛芬按每日0.002 g灌胃2 mL/只，中药低剂量组给予香延止痛方水煎剂2 mL/只(含生药2.38 g)，中药高剂量组给予香延止痛方水煎剂2 mL/只(含生药11.9 g)。各组均连续灌胃6天。末次灌胃30 min，除空白组外，其余各组腹腔注射缩宫素，观察大鼠扭体潜伏时间及30 min内扭体反应次数。采用ELISA法检测各组子宫组织上清液INF-γ、IL-4水平，RT-PCR法检测子宫组织上清液INF-γ、IL-4 mRNA表达。结果 中药低、高剂量组30 min内扭体次数明显少于模型组(P均<0.05)，扭体潜伏时间有延长趋势(P均>0.05)。与空白组比较，模型组子宫组织上清液IFN-γ水平降低、IL-4水平升高，IFN-γ/IL-4降低，TNF-α mRNA表达降低，IL-4 mRNA表达升高(P均<0.05)；与模型组比较，中药低、高剂量组IFN-γ含量升高，IL-4含量降低，IFN-γ/IL-4升高，TNF-α mRNA表达升高，IL-4 mRNA表达降低(P均<0.05)；但中药低、高剂量组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。结论 寒凝血瘀型原发性痛经大鼠存在Th1/Th2平衡漂移，香延止痛方可能通过调节Th1/Th2的平衡状态缓解痛经症状。

原发性痛经；寒凝血瘀证；香延止痛方；中药；大鼠

原发性痛经临床常见,长期严重的原发性痛经可导致经血逆流，明显增加子宫内膜异位症、子宫腺肌病的发生率，使不孕症风险增加。据统计，大约10%的原发性痛经患者可发展为继发性痛经，继而引起子宫内膜异位症[1]。原发性痛经以寒凝血瘀证最为常见[2]，本研究参照相关文献[3，4]建立了寒凝血瘀证型原发性痛经大鼠模型，观察香延止痛方的治疗效果，并对其可能的作用机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 健康成年雌性Wistar大鼠50只，清洁级，2～3月龄，体质量180～200 g，由山东鲁抗动物饲料经销中心提供，动物合格证号：SCXK(鲁)20120002。所有大鼠于山东中医药大学附属医院实验动物中心分笼饲养，每笼5只，室温23～25 ℃，相对湿度50%～60%，通风及光照良好，标准鼠饲料常规喂养，自由摄食、饮水。香延止痛方，由醋香附、醋延胡索、肉桂、当归、赤芍、白芍、盐小茴香、干姜、陈皮、蒲黄、川芎、没药、肉豆蔻、甘草组成，由山东中医药大学附属医院中药房提供；布洛芬缓释胶囊(批号：H10900089，规格0.3 g/粒)，中美天津史克制药有限公司；所有引物由上海博尚生物技术有限公司设计合成。大鼠血清IFN-γ和IL-4 ELISA试剂盒，美国R&D公司。

1.2 动物模型制备及处理 所有大鼠适应性饲养1周，按随机数字表法将其分为空白组、模型组、西药组及中药低、高剂量组，每组10只。除空白组外，其余各组参照文献[3，4]建立寒凝血瘀证原发性痛经大鼠模型：每天定时置于冰块上20 min，连续12天，以寒冷刺激诱导形成寒凝血瘀证模型；同时，每天皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0.4 mg/只，第1天及第12天为0.8 mg/只(首、末次加倍以保证其血药浓度保持在一定水平)以使大鼠子宫同步化，并可提高大鼠子宫对催产素的敏感性，在第12天腹腔注射缩宫素2 U/只，使大鼠子宫产生强烈收缩，以制造寒凝血瘀证原发性痛经模型。寒凝血瘀证原发性痛经模型判定：大鼠出现寒战，蜷缩少动，反应迟钝，爪尾部紫暗，耳色暗红，呼吸弱，喜扎堆，被毛无光泽，舌质紫暗，舌下脉络增粗增长，并出现扭体反应。根据人与大鼠体表面积换算方法计算给药剂量，造模第7天开始，空白组和模型组给予蒸馏水2 mL/只，西药组给予布洛芬按每日0.002 g灌胃2 mL/只，中药低剂量组给予香延止痛方水煎剂2 mL/只(含生药2.38 g)，中药高剂量组给予香延止痛方水煎剂2 mL/只(含生药11.9 g)。各组均连续灌胃6天。

1.3 相关指标观察

1.3.1 扭体潜伏时间及扭体次数 除空白组外，其余各组末次给药30 min，腹腔内注射缩宫素2 U/只，记录自注射缩宫素开始至出现扭体的潜伏时间及30 min内扭体次数。

1.3.2 子宫组织上清液IFN-γ、IL-4含量 各组大鼠麻醉后固定于手术板上，取出子宫，剪碎，200目铜网研磨过滤，1×PBS冲洗，400 g离心6 min，取上清。采用ELISA试剂盒说明加入稀释好的标准品及待测样品于反应孔内，温育，洗涤；加入酶标试剂50 μL，温育，洗涤；加入底物，37 ℃避光显色15 min，加入终止液，采用酶标仪测定各孔光密度(OD)值，利用CurveExpert1.3软件计算子宫组织上清液IFN-γ、IL-4水平，并计算IFN-γ/IL-4。

1.3.3 子宫组织IFN-γ、IL-4 mRNA表达 采用RT-PCR法。取部分子宫组织，Ficoll密度梯度离心法分离子宫组织单个核细胞，制成细胞悬液。提取细胞总RNA，采用oligo dT为逆转录反应引物，取2.5 μg总RNA按RT试剂盒说明逆转录cDNA 20 μL。引物序列：TNF-α上游引物：5′-GCACCCCCAACCTATGAAGA-3′，下游引物：5′-CGGGAGCACTTGTCTACCTC-3′，扩增产物471 bp；IL-4上游引物：5′-CCTTGCTGTCACCCTGTTCT-3′，下游引物：5′-TCATTCACGGTTGCAGCTTCT-3′，扩增产物336 bp。总反应体系为25 μL，包含RT产物5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，上下游引物各0.25 μL(25 pmol)，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，Taq DNA聚合酶 0.5 μL，DEPC水14 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃ 1 min，58 ℃～60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共26个循环，最后70 ℃延伸10 min。1.5 %凝胶(EB染色)水平电泳，采用Alpha凝胶成像系统分析图像。以β-actin为内参照，TNF-α、IL-4 mRNA条带灰度值与同步β-actin条带灰度值比值作为TNF-α、IL-4 mRNA的相对表达量。

2 结果

2.1 各组扭体潜伏时间及30 min内扭体次数比较 实验过程中，空白组、中药低剂量组和中药高剂量组各死亡1只，模型组死亡2只。各组扭体潜伏时间及30 min内扭体次数比较见表1。

表1 各组扭体潜伏时间及30 min内扭体次数比较

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与西药组比较，#P<0.05。

2.2 各组子宫组织上清液IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4比较 见表2。

表2 各组子宫组织上清液体IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4比较

注：与空白组比较，△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05；与西药组比较，#P<0.05。

2.3 各组子宫组织TNF-α、IL-4 mRNA表达比较 见表3。

表3 各组子宫组织TNF-α、IL-4 mRNA相对表达量比较

注：与空白组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.01。

3 讨论

原发性痛经属中医学“月经来腹痛”、“经行腹痛”“经痛”范畴，其病位在冲任、子宫，变化在气血，病机为不通则痛或不荣则痛[5]，常见证型为气滞血瘀、寒凝血瘀、湿热瘀阻、气血虚弱、肝肾亏损。有研究表明，寒邪是其主要病因，寒邪所致寒凝血瘀是最常见病机[6]。《素问·举痛论》所言：寒气入经而稽迟，泣而不行，客于脉外则血少，客于脉中则气不通，故卒然而痛，即不通则痛。

Th1和Th2细胞均属于辅助T细胞。未受抗原刺激的初始CD4+T细胞为Th，受到不同性质的抗原或细胞因子等因素的调控，可向不同谱系分化。在正常机体内，Th1细胞和Th2细胞通过分泌细胞因子参与不同的免疫反答，可互相调节或产生交叉调节作用，一般处于相对平衡的状态。但当人体发生功能异常时，机体免疫系统选择某一亚群为主的应答，这种Th细胞就会正反馈地增强自身优势，压制另一亚群的发展，即表现出Th1/Th2平衡偏向其中一方，即Th1/Th2平衡漂移现象。

目前已有研究报道，原发性痛经患者体内存在Th1/Th2平衡漂移现象。张茜薇等[7]研究认为，内分泌-免疫网络失调是原发性痛经的发病原因之一，表现为Th2过度表达。而抑制Th2细胞因子过度表达，促使Th1/Th2趋于平衡可改善原发性痛经患者内分泌-免疫网络失调的内环境达到治疗目的。蒋竞等[8]研究发现，雌二醇(E2)水平可影响体内Th1/Th2平衡，过高的E2引起Th1/Th2平衡向Th2漂移。E2及其受体表达水平升高，可引致相关致痛物质如PGF2α、TXB2、ET等含量过高，致使子宫肌痉挛、缺血进而产生疼痛[9]。此外，Th1和Th2亚群相关细胞因子亦与前列腺素的分泌密切相关[10]，其中TNF可刺激子宫内膜巨噬细胞产生PGE2，而IL-4可抑制PGE2的产生[11]。

香延止痛方是王东梅教授在长期临床实践中总结、提炼出来用于治疗痛经的有效方剂，具有温经散寒、化瘀止痛之效，临床疗效确切。前期动物实验表明，香延止痛方可显著延长痛经模型小鼠的扭体反应潜伏期，减少扭体反应次数，降低痛经模型大鼠子宫组织PGF2α含量，提高PGE2含量[12]。现代药理学研究也证实，香延止痛方中组药具有明显的镇痛作用。如陈运等[13]研究发现，香附挥发油0.1 g/kg灌胃能够显著减少醋酸引起的小鼠15、30 min内扭体次数，与0.03 g/kg阿司匹林效果相当；白芍总苷可显著降低醋酸引起的小鼠扭体次数，亦具有较好的镇痛效果[14]。

本研究显示，模型组、西药组及中药低、高剂量组扭体潜伏时间比较差异无统计学意义，但较模型组有延长趋势；而30 min扭体次数西药组及中药低、高剂量组较模型组明显降低，且中药低、高剂量组效果更好。说明香延止痛方可缓解寒凝血瘀证原发性痛经大鼠痛经症状。本研究还发现，模型组存在Th1/Th2失衡，平衡向Th2亚群漂移，即子宫组织IFN-γ降低、IL-4升高；西药组及中药低、高剂量组子宫组织IFN-γ均较模型组升高，IL-4含量均较模型组降低，以西药组效果最好，而中药低、高剂量组比较无统计学差异，说明香延止痛方能诱导Th1/Th2平衡向Th1亚群漂移。本研究还发现，西药组及中药低、高剂量组子宫组织上清液IFN-γ mRNA升高，IL-4 mRNA降低，与子宫组织IFN-γ、IL-4变化趋势一致，说明香延止痛方可通过调节IFN-γ、IL-4 mRNA表达维持Th1/Th2亚群处于平衡状态，进而改善痛经症状。 综上所述，香延止痛方能明显改善寒凝血瘀证原发性痛经大鼠的症状，其作用机制可能与调节Th1/Th2亚群的平衡状态有关。但其具体机制和作用靶点还需在以后的课题中进一步深入研究。

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山东省重点研发计划项目(2015GSF119010)。

王东梅(E-mail: 214693067@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.011

文献标志码：A 文章编号：1002-266X(2017)19-0040-03

2016-12-19)