玄参抗内毒素性急性肺损伤活性的谱效关系研究

2017-06-05王晴韩文杰张旗陈丹阳高菁丁楠张迅杰李强

中医药信息 2017年3期

关键词：玄参药效白细胞

王晴，韩文杰，张旗，陈丹阳，高菁，丁楠，张迅杰，李强

(北京中医药大学，北京 100102)

玄参抗内毒素性急性肺损伤活性的谱效关系研究

王晴，韩文杰，张旗，陈丹阳，高菁，丁楠，张迅杰，李强*

(北京中医药大学，北京 100102)

目的：分析玄参不同提取部位的高效液相特征图谱与抗内毒素性急性肺损伤活性之间的相互关系。方法：通过HPLC-MS测定分析玄参不同提取部位的HPLC特征图谱，利用气管滴注LPS的方法复制急性肺损伤模型并测定肺泡灌洗液中白细胞数目及肺的湿干比，运用偏最小二乘回归分析法研究谱效之间的关系，并用HPLC-MS/MS指认样品主要成分的峰。结果：各提取部位对急性肺损伤大鼠均有一定的作用，通过谱效分析得出3个药效贡献率较大的成分，分别是哈帕苷、安格洛苷C、毛蕊花糖苷。结论：本研究初步确定玄参抗内毒素性急性肺损伤的物质基础为哈帕苷、安格洛苷C、毛蕊花糖苷。

玄参；特征图谱；谱效分析；急性肺损伤

玄参为玄参科植物玄参(ScrophularianingpoensisHemsl.)的干燥根，性寒，味苦、甘、咸；归肺、胃、肾经；具有清热凉血，泻火解毒，滋阴生津，润燥通便的功效，为温病热毒证常用药，出现在“清营汤”“清瘟败毒饮”等经典治疗热毒血证的方剂中。现代药理研究表明玄参具有抗炎镇痛、抗菌、增强免疫、抗氧化、抗疲劳、抗血小板凝集等药理作用[1]。急性肺损伤的临床表现常伴有炎症，发热，咳喘等症状，属于中医热毒营血证的范畴，因此，从药效学角度提示玄参有治疗急性肺损伤的潜力。玄参化学成分十分丰富，主要包括环烯醚萜、苯丙素、黄酮类物质，另外还含有少量的多糖、生物碱、有机酸、挥发油、植物甾醇等化合物[2-3]。课题组前期研究表明，玄参对内毒素性急性肺损伤有一定的防治作用，但其物质基础尚不清楚。因此本实验研究玄参不同提取部位对内毒素性急性肺损伤的保护作用，并采用偏最小二乘回归分析法研究不同部位HPLC特征图谱与药效之间的关系，以获得的玄参抗急性肺损伤的主要活性成分。

1 材料

RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；美国 Agilent 1100 HPLC /MSD Trap (G1376A 毛细管泵，G1315B 二极管阵列检测器，离子阱质谱仪)；KQ-500E 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；1/10万电子分析天平(CAP225D Sartorius)；甲醇为色谱纯、流动相水为超纯水，其余试剂均为分析纯；脂多糖LPS(L2880，sigma)；血细胞分析仪(XFA6100A)；玄参购买于安国药材市场，由北京中医药大学刘春生老师鉴定；清洁级SD雄性大鼠90只，体质量190～210 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

2 方法与结果

2.1 玄参不同提取部位的制备

玄参药材6份，每份200 g，分别用10倍量的水、30%、50%、70%、90%的乙醇提取3次，每次1 h，共制备2份水提液，将其中一份水提物浓缩后用95%乙醇醇沉终浓度为80%，低温静置48 h后去除沉淀。所有提取物减压浓缩至无醇味，使最终含有生药量0.5 g/ml。

2.2 LC-MS特征图谱的建立

2.2.1 色谱条件

色谱柱Agilent Zorbax SB-C18( 4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ；柱温30℃；流速 1. 0 ml/min；进样量10 μL；流动相A为甲醇、B为0.1%醋酸水，梯度洗脱0～40 min(5%～35%A)，40～60 min(35%～50%A)，60～80 min(50%～65%A)。检测波长在290 nm下，样品各色谱峰具有较好的分离度，且峰相对较多，而哈帕苷为玄参的指标性成分，且只有末端吸收，结合相关文献[4]选择210 nm、290 nm为检测波长。

2.2.2 质谱条件

离子阱质谱，离子源：ESI；检测模式为负离子模式检测；离子喷射电压-4 500 V；毛细管电压自动；雾化气压35 psi；干燥气流速11 L/min;干燥器温度350℃；扫描质量范围m/z 100～1 500。

2.2.3 供试品溶液的制备

精密量取各提取物含生药量0.5 g/ml，离心取上清液过0.22 μm微孔滤膜，即得各供试品溶液。

2.2.4 对照品溶液的配置

分别精密称取哈帕苷、安格洛苷C、毛蕊花糖苷对照品适量，用甲醇溶解定容，并过0. 22 μm 微孔滤膜，即得各对照品溶液。

2.2.5 样品测定

取各供试品溶液进行液相及液质联用分析，进样量为10 μl，在290 nm波长下记录80 min的色谱图和质谱图，如图1所示，290 nm波长下，从6组液相图谱中选择20个响应度较高的峰。210 nm波长下选择哈帕苷的峰如图2所示，并按出峰时间依次排列，见表1(其中6号峰为210 nm波长下哈帕苷色谱峰)。哈帕苷、安格洛苷C、毛蕊花糖苷标准品及样品的紫外图谱如图3所示，玄参质谱总离子流图如图4所示，通过查阅文献及标准品对照，对玄参LC-MS/MS图谱进行解析，选中的21个峰共指认出9个化合物，见表2。

图1 各组提取物HPLC液相图谱(290 nm)注：S1:水提；S2:30%醇提；S3:50%醇提；S4:70%醇提；S5: 90%醇提；S6:水提醇沉。

图2 各组提取物哈帕苷HPLC峰(210 nm)注：A：水提；B：30%醇提；C：50%醇提；D：70%醇提；E：90%醇提；F：水提醇沉。

表1 各样品HPLC色谱峰的峰面积

No.tR/min水提30%醇提50%醇提70%醇提90%醇提水提醇沉14.209464.7557.2634.8589.9406.1373.626.064606.1665.1721683.9951.4510.138.028926.9724.5806878.41361.41306.6410.4611136.2562.4458.9573.2606.81125.9513.711139.1169.1136.5151.5137.8113.66*16.28318014.316208.317748.418014.313013.117404.7720.939719.6595.8701.1731.9439.4621.6828.557202.7221.7230234135.2153.9930.792524.9366.8311.5361.1358.91981033.641164.6219.1110.1187.6123.2165.31135.248669.2533.6363.6490.8375.8628.81239.116517365.5356.1394.2273.9483.61345.505223.6498.9438.7413.8263.63431446.427676.1837.1897.81141.4633.8773.81550.232659.9414.6354.2395.5284.7711.81656.2175744.95283.25282.15244.63320.95491.91758.7556268.257345011.95249.84174.15716.91860.623570.8360.3244.8290.5261.85371963.676192.2175.8155.4150.4117.8170.32065.27665.276141.7118.4131.2100.9159.12172.9715402.55654.35874.3526950045419.4

注：*为210 nm波长下所出的峰。

图3 标准品及样品紫外图注：A：哈帕苷标准品；B：样品；C：毛蕊花糖苷标准品；D：样品；E：安格洛苷C标准品；F：样品。

图4 玄参提取物总离子流图

表2 HPLC-MS/MS色谱峰指认

No.tR/minm/z[M-H]-裂解碎片分子式化合物推测410.461387.366387,225,123C17H24O10栀子苷[5]616.283363.129201,183,165,157,139C15H24O10哈帕苷[6]720.939487.144307,179,161,135C21H28O13肉苁蓉苷F[6]930.792487.1463341,325,307,163,145C21H28O13Acretoside1345.505471.149323,219,189,161,147C21H28O12sibiriosideA[6]1446.427623.1971461,315,179,161,135C29H36O15毛蕊花糖苷[6]1656.217783.2716607,589,461,193,175C36H48O19安格洛苷C[6]1758.755147.0451103C9H8O2肉桂酸[7]2172.971493.1704345,183,165,147C24H30O11哈帕俄苷[6]

2.3 不同提取部位的药效试验

2.3.1 动物模型的建立

90只雄性SD大鼠随机分为9组，正常对照组(NS)、模型组(LPS)、阳性药组、水提组、30%醇提组、50%醇提组、70%醇提组、90%醇提组、水提醇沉组，每组10只。按照LPS 5 mg/kg 气管滴注法复制ALI模型。各组均采用10%的水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，50°仰卧固定，剥离气管，用1 ml注射器缓缓滴注LPS后，直立旋转，使LPS尽量在肺内均匀分布。正常对照组大鼠：气管滴注等体积的生理盐水。阳性药组：在气管滴注LPS前，腹腔注射地塞米松注射液(2 mg/kg)。造模后12 h取材。

2.3.2 大鼠肺泡灌洗液中白细胞数目和肺湿干比测定

大鼠麻醉后腹主动脉取血处死，剪开颈部皮肤并打开胸腔，使气管充分暴露，分离并结扎右支气管；主气管插管，向左肺缓缓注入2.5 ml冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS )，待左肺逐渐变得鼓起、泛白时，轻轻抚摸数次，并回抽1.5 ml肺泡灌洗液，如此平行进行3次；获取BALF(4℃，1 300 rmp，10min)离心，沉淀用PBS重悬，利用血细胞分析仪记录BALF中白细胞数量；取右肺上叶称取湿重(W)后置于80℃烘箱中，烘至恒重，记录干重(D)，计算肺的湿干比(W/D)。白细胞抑制率(%)=(LPS组白细胞数目-给药组白细胞数目)/LPS组白细胞数目×100%；湿干比下降率(%)=(LPS组湿干比-给药组湿干比)/LPS组湿干比×100%。结果显示LPS组白细胞数目和湿干比均高于正常对照组(P<0.05)，各提取物白细胞数目和湿干比均小于LPS组，其中水提、50%醇提、70%醇部位能更显著的降低白细胞数目；除水提醇沉部位外其他各部位均能抑制急性肺损伤肺的水肿情况，结果见表3。

表3 BALF白细胞计数及肺湿干比

注：与正常组比较，#P<0.05，与模型组比较，*P<0.05。

2.4 统计学分析

2.5 谱效关系研究

由于实验中药效数据和指纹图谱数据有不同的度量单位(即量纲不同)，所以对原始数据进行标准化处理，以消除变量量纲差异。以通过标准化处理的特征图谱中各化学成分的峰面积为自变量，以标准化处理后的药效抑制率指标作为因变量，利用METALAB7.4.0统计软件，运用偏最小二乘回归法进行谱效分析，计算出各自变量对应因变量的回归系数。其中回归系数代表各自变量对因变量的贡献大小，以回归系数进行建模，即得回归方程。

以各组提取物对白细胞的抑制率作为因变量得到回归方程：

y1=0.142 0x1+(-0.016 6)x2+(-0.040 5)x3+0.021 1x4+(-0.142 9)x5+0.237 0x6+0.295 2x7+0.147 0x8+0.109 2x9+(-0.208 5)x10+(-0.043 3)x11+(0.114 8)x12+(-0.140 5)x13+0.186 0x14+0.014 8x15+0.098 3x16+(-0.012 0)x17+(-0.035 1)x18+(-0.025 3)x19+(-0.192 1)x20+(-0.021 6)x21，R2=0.997 6

以各组提取物对湿干比的下降率作为因变量得到回归方程：

y2=0.051 0x1+0.072 1x2+0.021 0x3+0.000 2x4+0.147 9x5+0.114 1x6+0.220 6x7+0.132 5x8+0.254 8x9+0.223 8x10+0.084 8x11+0.063 7x12+(-0.172 6)x13+0.424 2x14+(-0.064 6)x15+(-0.045 6)x16+(-0.039 5)x17+(-0.062 7)x18+(-0.161 2)x19+(-0.132 6)x20+(-0.513 5)x21，R2=0.999 4

由于回归方程是有各回归系数与峰面积乘积之和组成，所以x对y的贡献率取决于系数和峰面积两个因素，选择与y呈正相关的峰(回归系数为“+”)，并以所有正相关系数与峰面积乘积之和作为分母，以各个正相关系数与峰面积乘积作为分子，得出自变量x对y的贡献率。有药效指标可以看出玄参水提部位对白细胞的抑制较强，玄参50%醇提部位对湿干比的干预作用较强，对二者各峰进行贡献率计算，结果见表4。

表4 玄参提取物中各峰对药效的贡献率

有贡献率可知，6号、16号峰对y1的贡献率达89.215 2%，6号、14号峰对y2的贡献率达83.829 6%，由上文可知6号、14号、16号峰分别为为哈帕苷、毛蕊花糖苷、安格洛安C。结果提示，玄参对抗内毒素性急性肺损伤的活性物质可初步确定为哈帕苷、毛蕊花糖苷、安格洛安C。

3 讨论

由于哈怕苷只有末端吸收，且为2010年《中国药典》规定的玄参指标性成分，而在290 nm波长下，样品各色谱峰具有较好的分离度，且峰相对较多，基本显示玄参化学成分的全貌，故最终确定检测波长为210 nm、290 nm。

中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以[8-13]及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。但单纯的指纹图谱不能确定到底是中药中哪个或哪类化合物在药效中起主要作用，而谱效关系是将指纹图谱与药效评价相结合，进行相关研究，不仅可以阐明中药可能的活性成分还可以标示各成分之间的协同、拮抗作用，并实现中药内在质量的综合评价和控制，指导和加速新药的开发与研究[14-15]。构建谱效关系的数据处理方法是谱效分析的关键步骤，目前谱效关系中常用的谱效分析方法主要有回归分析、相关分析、主成分分析、灰色关联度分析、聚类分析、人工神经网络模型分析等。一般谱效关系研究中常同时使用多种数据分析方法，更全面有效的揭示谱效关系[16-18]。本课题研究采用偏最小二乘回归分析法，将6组不同提取部位的共有峰峰面积与药效数据标准化处理后进行关联分析。

本实验研究结果表明玄参中16种化合物与药效呈正相关，初步可以判断这些成分对急性肺损伤的防治起协同作用。根据16种化合物的贡献率大小得出3个主要活性成分即为哈帕苷、毛蕊花糖苷和安格洛苷C。相关研究表明哈帕苷、安格洛苷C、具有抗炎、抗氧化作用[19]，安格洛苷C、毛蕊花糖苷能对抗血小板凝集，能降低血浆纤溶酶原启动抑制剂-1水平[20]。这些药理活性均与急性肺损伤的治疗机制相对应[21-22]。提示玄参对急性肺损伤有一定的治疗作用，值得进一步开发研究。

[1] 胡瑛瑛,黄真.玄参的化学成分及药理作用研究进展[J].浙江中医药大学报,2008,32(2):268-270.

[2] 李医明,蒋山好,朱大元.玄参属植物化学成分与药理活性研究进展[J].中草药,1999,30(4):307-310.

[3] 谢小艳,夏春森.中药玄参的化学成分及药理研究进展[J].亚太传统医药,2010,6(5):121-125.

[4] 白云娥,袁鹏飞,王庆辉,等.HPLC-UV波长转换法测定玄参药材及饮片中哈巴苷与哈巴俄苷的含量[J].中国中药杂志,2011,36(19):2697-2702.

[5] 卢建秋,孙明谦,张宏桂.栀子苷和梓醇的电喷雾质谱裂解机制研究[J].中草药,2008,39(7):1011-1014.

[6] Wu Q,Yuan Q,Liu EH, et al. Fragmentation study of iridoid glycosides and phenylpropanoid glycosides in Radix Scrophulariae by rapid resolution liquid chromatography with diode-array detec-tion and electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry[J].Biomed Chromatogr,2010,24(8) : 808．

[7] Nguyen AT,Fontaine J,Malonne H,et al.A sugar ester and an iridoid glycoside from Scrophularia ningpoensis [J].Phytochem,2005,66(10):1186．

[8] 赵旭,马晓鹏.GC-MS-AMDIS结合保留指数技术用于缬草挥发性成分指纹图谱的研究[J].中医药信息,2015,32(3):29-31.

[9] 杨柳,张颖,刘季田媛,等.牛膝各化学拆分组分指纹图谱研究[J].中医药信息,2015,32(6):16-19.

[10] 范卓文,谢明,李晓梅,等.东北三省不同采收期五味子HPLC指纹图谱的研究[J].中医药信息,2015,32(5):57-60.

[11] 程丽丽,孙志蓉,朱南南,等.紫花地丁洗脱部位指纹图谱特征与其抗真菌作用的灰色关联度分析[J].中医药学报,2015,43(6):49-53.

[12] 刘斌,熊辉,朴成玉,等.补阳还五汤的HPLC指纹图谱研究[J].中医药学报,2016,44(4):5-9.

[13] 郝变,潘丽丽,袁少雄,等.不同品种、产地瓜蒌皮中游离氨基酸类成分指纹图谱研究[J].中医药学报,2015,43(2):14-18.

[14] 马培,张鑫瑶,许利嘉,等.大黄属药用植物抗HIV-1活性的谱效关系研究[J].中国中药杂志,2013,38(15):2434-2437.

[15] 吴龙火,温慧岭,金奇,等.九里香指纹图谱与其抗炎活性的灰关联度分析[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(4):338-342.

[16] 张晓娟，左冬冬，谢国梁，等.“谱效相关”研究新进展[J].中医药学报,2015,43(1):78-80.

[17] 何前松,杨卫平,张丽艳,等.疏毛吴茱萸提取物缓解家兔离体肠肌痉挛的谱效关系研究[J].时珍国医国药,2012,23(5):1108-1110.

[18] 宋玉超,马海波,张旗,等.赤芍、白芍的LC-MS色谱峰与细胞抑制率的谱效关系研究[J].现代药物与临床,2012,27(2):103-106.