模拟脑组织生物力学环境下温敏脐带间充质干细胞的分化特性研究

符锋　陈以胜　李晓红

[摘要] 目的 模擬脑组织弹性模量制备相应二维培养基，比较亚低温联合温敏脐带间充质干细胞（tsUC）与常温下脐带间充质干细胞（UC）的分化特性。 方法 应用单、双丙烯酰胺的聚合作用，制备弹性模量为0.5 kPa的聚丙烯酰胺（PA）水凝胶，用于模拟脑组织的生物力学环境，并测其弹性模量。从新生儿脐带中分离培养脐带间充质干细胞，通过感染携温度敏感型猿猴病毒40大T抗原（ts-SV40LT）基因的逆转录病毒来制备tsUC。实验分为3组：UC+常温+玻片组（A组）、UC+常温+0.5 kPa组（B组）、tsUC+亚低温+0.5 kPa组（C组）。动态观察各组细胞的生长情况和形态变化，并于7 d后行细胞免疫荧光检测各组细胞的分化水平并计算分化神经元的轴突长度。 结果 PA水凝胶弹性模量的检测结果为（0.50±0.03）kPa。B、C两组部分细胞出现细长的胞突，并存在β-tubulin Ⅲ阳性细胞，A组细胞镜下无明显神经元形态，也无β-tubulin Ⅲ阳性表达。B、C两组的神经元分化率以及荧光下轴突长度均明显高于A组，但组间差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 在模拟脑组织弹性模量的环境中，tsUC具有向神经元分化的能力，可应用于亚低温治疗下脑损伤修复的细胞移植研究。

[关键词] 温敏脐带间充质干细胞；聚丙烯酰胺水凝胶；弹性模量；生物力学

[中图分类号] R651.15 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（c）-0014-04

[Abstract] Objective To manufacture two-dimensional culture medium of brain tissue elastic modulus， and to compare the differentiate property of temperature-sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells （tsUC） under mild hypothermia treatment （MHT） and umbilical cord mesenchymal stem cells （UC） under normal temperature （NT）. Methods Acrylamide and bis-acrylamide were applied to synthesise polyacrylamide hydrogel of 0.5 kPa in elasticity modulus. UC were isolated from umbilical cord of the newborn， and then the tsUC were obtained through the infection of temperature-sensitive Simian 40 Large T-antigen （ts-SV40LT） retrovirus. There were three experiment groups in this study， including UC+NT+glass （group A）， UC+NT+0.5 kPa PA （group B）， and tsUC+MHT+0.5 kPa PA （group C）. Cell growth and morphological changes in each group were given dynamic observation. 7 days later， cell immunofluorescence were implemented， with the differentiation level of each group estimated and the axon length of the differentiated neurons calculated by using Image J software. Results The elasticity modulus of PA gels was （0.50±0.03） kPa. A small amount of cells resembling the neurons were presented in group B and C， with small soma and long， slender protuberances. Cell immunofluorescence statistics demonstrated that the cells differentiated into neurons expressing beta-tubulin Ⅲ. The neuron differentiation rate and axon length were significantly higher than that of group A， which have no beta-tubulin Ⅲ expressing. However， there was no obvious difference between group B and C （P > 0.05）. Conclusion tsUC can differentiate to neurons in the environment mimicking the elastic modulus of brain tissue， which can be applied into cell transplantation of brain injury under MHT.

[Key words] Temperature-sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells； Polyacrylamide gels； Elastic modulus； Biomechanics

细胞生物学性能的调控机制与细胞的生物力学特性有关，包括细胞内部的收缩力、细胞与基质之间的牵张力、细胞与细胞之间的相互作用力等[1-2]。体外培养干细胞时，培养基质的弹性模量是细胞生物力学的一个重要体现，且对干细胞分化具有调节作用[3-5]。人脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC）具有多向分化的潜能，在弹性模量为11～30 kPa的培养基中多向成骨细胞分化，在2.5～5.0 kPa的培养基中多向脂肪细胞分化，而在0.1～1.0 kPa的培养基中，则可能向神经元进行分化[4，6]。

本课题组前期已经建立了一种温敏脐带间充质干细胞（temperature-sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells，tsUC）系，发现tsUC在亚低温（mild hypothermia treatment，MHT）作用下可促进创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）大鼠神经功能的恢复[7-8]，并对tsUC的增殖、温度敏感等特性进行了初步探讨[9]，但其生物力学特性尚不明确。本实验拟在体外对人UC进行扩增以及力学诱导，观察其在模拟脑组织硬度的培养基中的分化情况，从力学角度探讨MHT联合tsUC的分化特性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新生儿脐带（由武警后勤学院附属医院妇产科提供，已通过武警后勤学院附属医院伦理协会审查），携温度敏感型猿猴病毒40大T抗原（ts-SV40LT）基因的逆转录病毒（加利福尼亚大学，美国），神经元β-tubulin Ⅲ一抗及荧光标记二抗（Millipore，美国），UC流式细胞检测试剂盒（BD，美国），单丙烯酰胺（Amresco，美国），双丙烯酰胺（天津光复精细化工研究所），硝化纤维、苯基叠氮化物交联剂（sulfo-SANPAH）、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、二氯二甲基硅烷（天津鼎国生物技术有限责任公司），I型胶原蛋白（Sigma，美国）。

1.2 聚丙烯酰胺水凝胶的制备和检测

将单、双丙烯酰胺（0.03%～0.3%）按不同比例混合[10]，加入过硫酸铵（1/200 V）和TEMED（1/2000 V）置于凹槽中后盖以玻璃板。凝结后切取2 cm×1 cm×2 mm的样本，应用力学试验机（Instron 5865，美国）进行拉伸测试，重复测量10次，筛选出弹性模量为0.5 kPa的PA水凝胶。

1.3 模拟脑组织弹性模量二维培养基的制备

根据上述检测结果，配制弹性模量为0.5 kPa所对应的单丙烯酰胺和双丙烯酰胺混合液[11]。22 mm × 22 mm盖玻片表面均匀涂抹3-氨基丙基三甲氧基硅烷后浸泡在0.5%戊二醛溶液中，30 min后清洗、晾干，并在玻片表面涂硝化纤维以增加黏性。盖玻片均匀铺被25 μL混合液后加盖经二氯二甲基硅烷预处理的18 mm×18 mm盖玻片。待聚合完成后，暴露水凝胶并紫外消毒。将200 μL sulfo-SANPAH（50 mmol/L，pH=8.5）均匀滴在水凝胶表面，于无菌罩中紫外光活化5 min。将0.2 mg/mL的I型胶原蛋白均匀铺在水凝胶表面，0.2 mg/mL的I型胶原蛋白包被玻片作为对照组。

1.4 tsUC的建立与鉴定

从健康新生儿脐带中分离出UC，进行体外培养、扩增，用流式细胞分析仪（BD，美国）测定各类抗原的阳性率[6]。细胞融合率60%时，用含4 μg/mL聚凝胺的tsSV40LT病毒悬液对细胞感染48 h，并根据前期研究方法对细胞进行鉴定[7-9]。将感染成功的tsUC置于33℃培养箱中，余培养条件同UC[12]。

1.5 实验干预及分组

实验按培养温度和培养基弹性模量分为3组：UC+NT+glass组（A组）为玻片上常温培养UC；UC+NT+0.5 kPa组（B组）为0.5 kPa的PA水凝胶上常温培养UC；tsUC+MHT+0.5 kPa组（C组）为0.5 kPa的PA水凝胶上亚低温培养tsUC。各组细胞（5×103个/mL）均加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基，置于含5% CO2的培养箱中培养，并定期在相差显微镜（Optic BD200-PH，美国）下观察细胞的生长情况和形态变化。

1.6 细胞免疫荧光

各组细胞培养7 d后进行免疫荧光染色以检测细胞分化情况。加入羊抗大鼠β-tubulin Ⅲ一抗和荧光标记的二抗，细胞核DAPI染色，于倒置荧光显微镜（Leica DMI4000B，德国）下观察。随机取10个位点计数，并计算各组阳性细胞占细胞总数的百分比，即为近似分化率。应用Image J软件测量神经元的轴突长度，计算各组神经元轴突的平均长度[13]。

1.7 统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 tsUCMSCs培养和鉴定

流式细胞分析结果显示，细胞表面标记CD90、CD105、CD73呈阳性表达，CD34、CD116、CD19、CD45、HLA-DR呈陰性表达。感染成功的tsUC呈漩涡状生长，类似于UC，形态多为梭形、多边形或成纤维细胞形态，大小均一（图1）。

2.2 以PA水凝胶为基础的细胞培养基

通过力学试验机的测量及筛检，最终得到弹性模量为（0.50±0.03）kPa的PA水凝胶。按相应比例于盖玻片上配制出该弹性模量的培养基。见图2。

2.3 光镜下细胞形态变化

各组细胞均贴于玻片生长，其中A组细胞在7 d内未发生明显变化，B、C组细胞的胞体大致呈圆形或椭圆形，与A组的细胞相比，胞体逐渐变小，并出现长而纤细的胞突。见图3。

2.4 细胞免疫荧光

B、C两组均有β-tubulin Ⅲ表达阳性的细胞，提示分化的神经元细胞；而A组无阳性表达。见图4。B、C组神经元总体分化率分别为11.3%和10.4%，差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.5 轴突长度分析

B、C两组细胞均有明显突起，B和C组分化的神经元轴突平均长度分别为（262.52±36.16）μm和（229.83±33.95）μm，差异无统计学意义（P > 0.05）。

3 讨论

细胞生物力学已逐渐成为医学领域研究热点。在各种内外机械因素影响下，生物学信息可通过力学信号转导作用于人体细胞，影响细胞的生长、增殖和分化[14]。干细胞原位移植后，其周围不同弹性基质可诱导其分化为更接近宿主组织的细胞[15-16]。Engler等[6]研究证实，在弹性模量为0.1～1.0 kPa的培养条件下，间充质干细胞可向神经元分化。本研究以培养基弹性模量这一力学特性为基础，探讨了在模拟正常脑组织弹性模量的培养条件下tsUC向神经元分化的水平。在培养基的制备方面，本研究借鉴了Engler等[6]和Pelham等[11]的方法，根据单、双丙烯酰胺的不同混合比例，制备模拟脑组织硬度的PA水凝胶，并应用力学试验机对其进行检测，保证了培养基弹性模量的精确性，结合细胞培养液，制备二维培养基。

光镜下可见，在弹性模量为0.5 kPa的培养基中，tsUC向神经样细胞变化，胞体变小、胞突伸长，可见典型的轴突，这与相同培养基中UC的细胞形态变化类似，而玻片上的UC无明显形态变化。免疫荧光结果显示，神经元表达只在弹性模量为0.5 kPa的培养基中出现，且tsUC和UC之间无明显差异。上述结果表明，与UC相比，tsUC在亚低温条件下的分化能力基本不受影响，可向神经元分化。由此说明在亚低温的作用下，tsUC的生物力学性能并未发生明显变化。

生物力学在神经组织方面也有重要意义，正常脑组织的软基质能够诱导间充质干细胞向神经元分化，因此模拟脑组织能保证移植干细胞的存活率和分化率。TBI后不仅脑组织的理化性质受到破坏，而且脑细胞原本的力学微环境也发生相应改变，此时脑组织硬度明显增大[19-20]，这便影响脑组织的原位细胞以及损伤处移植干细胞的生长和分化水平。本文以细胞生物力学为基础，模拟脑组织弹性模量，证实了亚低温作用下tsUC具有稳定的生物力学性能和神经元分化能力，从生物力学角度为亚低温联合tsUC移植治疗TBI的研究提供了重要依据，并推动该项研究向临床应用的转化。

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（收稿日期：2016-09-10 本文编辑：程 铭）