环磷酰胺对不同年龄小鼠免疫细胞损伤及修复作用的影响

林帅　陈孟毅　刘冰

[摘要] 目的 比较环磷酰胺对幼年鼠、老年鼠与成年鼠免疫系统的影响。 方法 雄性C57BL/6幼年、成年、老年鼠各32只，各年龄小鼠均随机分为对照组（12只）和模型组（20只）。模型组成年鼠、老年鼠腹腔注射环磷酰胺100 mg/kg，幼年鼠腹腔注射环磷酰胺72 mg/kg。对照组腹腔注射等剂量生理盐水。分别在给药后第3、7、14、28天采用流式细胞仪、血细胞计数仪检测各年龄3只对照组、5只模型组小鼠相关免疫指标。 结果 给药后，与成年鼠相比，幼年鼠胸腺CD8+T细胞、CD4+CD8+T细胞、血浆IgA、IgG损伤恢复情况更好（P < 0.05）；脾脏Treg细胞恢复情况较差（P < 0.05）。与成年鼠相比，老年鼠脾脏指数下降更明显（P < 0.05）；外周血NK细胞、B细胞、中性粒细胞、CD4+T细胞恢复情况较差（P < 0.05）；白细胞数下降更明显且预后较差（P < 0.05）。 结论 应用环磷酰胺后，幼年鼠免疫系统损伤、恢复情况与成年鼠基本一致。环磷酰胺对老年鼠免疫系统的损伤较成年鼠更严重且预后较差。

[关键词] 环磷酰胺；年龄差异；免疫细胞；损伤与修复

[中图分类号] R392.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（c）-0008-07

[Abstract] Objective To compare the effect of immune system injury induced by Cyclophosphamide among juvenile， adult and aged mice. Methods The 32 male C57BL/6 mice of every age were randomly divided into control group and model group. Every age control group had 12 mice and model group had 20 mice. Adult and aged mice were treated with Cyclophosphamide 100 mg/kg by intraperitoneal injection. Juvenile mice were treated with Cyclophosphamide 72 mg/kg by intraperitoneal injection. And the control mice were treated with saline in the same way as the Cyclophosphamide treated mice. Some immune indexes were measured by flow cytometer and blood-counter system at 3， 7， 14， 28 days after treatment. 3 mice of control group and 5 mice of model group of every age were measured every time. Results Compared with the adult mice， the proportion of thymus CD8+T cells， CD4+TCD8+T cells， plasma IgA， IgG had better prognosis （P < 0.05）， but spleen Treg cells had poor prognosis （P < 0.05）. Compared with the adult mice， spleen indexes of aged mice were reduced more seriously （P < 0.05）. The percentage of peripheral blood NK cells， B cells， neutrophils and CD4+T cells had poor prognosis （P < 0.05）； the number of white blood cell were reduced more seciously and it had poor prognosis （P < 0.05）. Conclusion After treatment with Cyclophosphamide， the damage and repair of juvenile mice′s immune system are consistent with the adult mice′s， but the damage and repair of aged mice′s are more severe.

[Key words] Cyclophosphamide； Different ages； Immune cells； Damage and repair

免疫系統可以对病原体侵入人体做出适度反应，从而保持人体的内环境稳定[1]。免疫系统的免疫应答可分为固有免疫和获得性免疫。固有免疫细胞是机体非特异免疫的重要组成部分，包括中性粒细胞、NK细胞等[2-3]。获得性免疫包括参与体液免疫的B细胞、参与细胞免疫的T细胞等。一般来说，人至青春期免疫系统才发育成熟，儿童免疫细胞表现出数量不足和功能不成熟[4]，成年人的免疫系统日趋成熟。随着年龄的增长，人的免疫功能逐渐衰退。60岁以上老人T细胞、B细胞、NK细胞等会出现生成数量减少或代谢活力下降等现象[5-6]。环磷酰胺作为一种免疫抑制剂，已有大量研究表明其能抑制体液和细胞免疫应答，对B细胞损伤作用尤为明显[7-9]。本实验结果为临床预测应用免疫系统抑制剂后儿童、老年人免疫系统的损伤情况与修复，以及临床药物剂量差异性选择提供了依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组与模型制备

健康3周龄（幼年鼠）、8周龄（成年鼠）、14月龄（近老年鼠，下文简称“老年鼠”）雄性C57BL/6小鼠（SPF级）各32只购于北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号：SCXK（京）2014-0004。动物实验研究遵循中国医学科学院医学实验动物研究所制定的有关实验动物保护和使用的指南，并经中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物伦理委员会批准。各年龄小鼠分为对照组（12只），模型组（20只）。模型组成年鼠、老年鼠腹腔注射环磷酰胺100 mg/kg，分两次隔天给药，50 mg/（kg·次）；幼年鼠环磷酰胺剂量为72 mg/kg[同种动物間剂量换算公式：Dose（b）=Dose（a）×（Wb/Wa）2/3，W为体重（kg）]，分两次隔天给药，36 mg/（kg·次）。对照组腹腔注射等剂量生理盐水。分别于给药后第3、7、14、28天检测各年龄小鼠相关免疫指标。每次检测各年龄对照组小鼠3只，模型组小鼠5只。

1.2 主要试剂与仪器

NK1.1、CD11b、F4/80、CD4、CD25、Foxp3抗体（eBioscience）；Foxp3 Buffer Set、CD8a、B220抗体（美国BD）。注射用环磷酰胺（江苏恒瑞）。小鼠IgA、IgG、IgM ELISA试剂盒（杭州联科）。137Csγ射线照射源，加拿大原子能有限公司，GAMMA-CELL40，剂量率0.80 Gy/min。流式细胞仪C6（美国BD），全自动血液分析仪MEK-7222K（日本光电），酶标仪MK3（美国ThermoMultiskan）。

1.3 实验方法

1.3.1 外周血血常规检测 给药后第3、7、14、28天，小鼠眼内眦取血，EDTA-K3抗凝，血细胞计数仪测定白细胞数（WBC）、淋巴细胞数、淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比。

1.3.2器官指数测定 小鼠称重后取胸腺、脾脏称重，计算胸腺、脾脏指数。器官指数=器官重量（mg）/小鼠体重（g）。

1.3.3 外周血IgA、IgG、IgM测定 样本孔10 000倍稀释的样本，复孔加入2倍稀释的标准品孵育2 h。洗涤后每孔加入检测抗体孵育1 h。洗涤后每孔加入100 μL显色底物，避光孵育30 min后加入终止液。450 nm波长检测OD值。

1.3.4 外周血淋巴细胞分型测定 每管取50 μL抗凝血，分别加入CD4/CD8a和NK1.1/F4/80/B220/CD11b混合流式抗体，避光孵育30 min后裂解红细胞，离心弃上清后洗涤，加入300 μL PBS，流式细胞仪检测NK细胞、巨噬细胞（CD11b+F4/80+）、B细胞、CD4+T细胞、CD8a+T细胞比例。外周血B220细胞、CD4+T细胞、CD8a+T细胞绝对数计算方法：细胞数（×109/L）=B220细胞、CD4+T细胞、CD8a+T细胞在总细胞中占比×淋巴细胞数。

1.3.5 脾脏淋巴细胞分型测定 取100 μL 107个/mL脾细胞悬液加到EP管中。加入CD4/B220/CD25混合流式抗体。避光孵育30 min后裂解红细胞。离心弃上清后洗涤，使用Foxp3 Buffer Set处理细胞后，加入FOXP3流式抗体，避光孵育20 min。离心弃上清后洗涤，加入300 μL PBS，流式细胞仪检测B细胞、Treg细胞（CD4+CD25+FOXP3+）比例。

1.3.6 胸腺淋巴细胞分型测定 取100 μL 107个/mL胸腺细胞悬液加到EP管中，加入CD4/CD8a混合流式抗体，避光孵育30 min，离心弃上清后洗涤，加入300 μL PBS，流式细胞仪检测CD4+T细胞、CD8a+T细胞、CD4+CD8a+T细胞比例。

1.4 统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0软件处理数据、作图，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 环磷酰胺对不同年龄小鼠白细胞及分类的影响

给药后，对比WBC结果发现，成年鼠白细胞数在第3天降到（52.7±8.3）%，幼年鼠变化趋势与成年鼠相似，老年鼠在第3天降到（27.3±4.2）%，下降幅度远大于成年鼠（P < 0.05），且第28天无法恢复至正常水平，恢复能力弱于成年鼠（P < 0.05），见图1A。

给药后，对比中性粒细胞比例发现，成年鼠中性粒细胞比例在第7天升高到（130.9±4.1）%，第14天后可恢复至正常水平。幼年鼠在第7天升高到（221.5±23.6）%，升高幅度大于成年鼠（P < 0.05），第14天后亦可恢复至正常水平。老年鼠比例在第7天下降到（59.4±6.8）%，趋势与成年鼠相反（P < 0.05），第28天恢复情况与成年鼠不同（P < 0.05）。见图1B。

给药后，对比淋巴细胞比例发现，成年鼠淋巴细胞比例在第7天小幅下降到（85.2±8.2）%，第14天后可恢复到正常水平。幼年鼠变化趋势与成年鼠相似。老年鼠在给药后第3天即上升到（119.5±12.0）%，趋势与成年鼠不同（P < 0.05），第14天后可恢复到正常水平。见图1C。

2.2 环磷酰胺对不同年龄小鼠器官指数的影响

对比胸腺指数发现：成年鼠胸腺指数在给药后第3天下降至（58.1±8.0）%，至第28天，只能恢复至（77.2±11.8）%。幼年鼠损伤及恢复情况与成年鼠相似。老年鼠在给药后第3天未有明显变化，趋势与成年鼠不同（P < 0.05），第7天下降至（55.7±15.3）%，降至最低值时间晚于成年鼠，第14天后可恢复至正常值。见图2A。

对比脾脏指数发现：成年鼠脾脏指数在第3天下降至（73.5±6.8）%，第14天后可恢复至正常值。幼年鼠在第7天下降至（68.3±7.0）%，降至最低值时间晚于成年鼠，恢复情况与成年鼠相似。老年鼠在第3天下降至（40.8±4.7）%，下降程度大于成年鼠（P < 0.05），恢复情况与成年鼠相似。见图2B。

2.3 环磷酰胺对不同年龄小鼠胸腺淋巴细胞分型的影响

给药后，对比CD4+T细胞比例发现：成年鼠在给药第3天，CD4+T细胞比例降低至（36.5±1.1）%，第7天后可恢复至正常值，但是第28天再次下跌至（26.7±4.8）%。幼年鼠在给药第3天小幅下降至（89.1±1.5）%，趨势与成年鼠不同（P < 0.05），第7天后即可恢复至正常值，整体变化趋势与成年鼠不同。老年鼠损伤、恢复情况与成年鼠类似。见图3A。

给药后，对比CD8+T细胞比例发现：成年鼠在给药第3天，CD8+T细胞比例下降至（35.9±10.4）%，第7天后可恢复至正常值，但第28天再次下跌至（13.2±2.1）%。幼年鼠在给药第3天下降至（71.1±4.4）%，趋势与成年鼠不同（P < 0.05），第7天后即可恢复至正常值范围。老年鼠损伤、恢复情况与成年鼠类似。见图3B。

给药后，对比CD4+CD8+T细胞比例发现：成年鼠在给药第3天，CD4+CD8+T细胞比例下降至（18.9±0.8）%，第7天后可恢复至正常值，但第28天再次下降至（2.9±0.2）%。幼年鼠在给药第3天下降至（63.4±5.1）%，下降趋势与成年鼠不同（P < 0.05），第7天后可恢复至正常值范围，至第28天，再次下降至（77.9±23.2）%，恢复趋势与成年鼠不同（P < 0.05）。老年鼠损伤、恢复情况与成年鼠类似，见图3C。

2.4 环磷酰胺对不同年龄小鼠脾脏淋巴细胞分型的影响

给药后，对比B细胞比例：成年鼠在给药后，B细胞比例持续走低，第14天达最低值[（59.9±8.3）%]，第28天可恢复至（86.7±6.9）%。幼年鼠、老年鼠在给药后无明显变化，均与成年鼠变化趋势不同。见图4A。

给药后，对比Treg细胞比例发现：成年鼠在给药第3天，Treg细胞比例下降至（59.1±22.7）%，至第7天下降至最低值（4.3±1.6）%，第28天可恢复至（126.7±17.4）%。幼年鼠损伤情况与成年鼠类似，但第28天仅能恢复至（66.5±3.2）%，恢复能力弱于成年鼠（P < 0.05）。老年鼠损伤、恢复情况与成年鼠类似。见图4B。

2.5 环磷酰胺对不同年龄小鼠外周血淋巴细胞分型的影响

给药后，对比NK细胞比例发现：成年鼠在给药第7天NK细胞比例下降至（29.9±7.0）%，至第28天，经过小幅反跳后恢复至（106.5±13.0）%。幼年鼠在给药后第3天无明显变化，至第7天，上升至（149.3±32.1）%，至第28天依然维持该水平，整体变化趋势与成年鼠不同。老年鼠在给药第3天，下降至（53.5±13.2）%，至第28天，依然维持该水平，整体变化趋势与成年鼠不同。见图5A。

给药后，对比B细胞绝对数发现：成年鼠在给药后第3天，B细胞比例骤降至（2.1±1.4）%，第14天反跳至（122.5±20.2）%，第28天回落到（57.1±11.5）%。幼年鼠损伤及恢复趋势与成年鼠类似，第28天恢复情况优于成年鼠（P < 0.05）。老年鼠在给药后第3天骤降至（1.1±0.3）%，至第7天可恢复至（25.4±18.7）%，至第28天一直维持该水平，恢复能力弱于成年鼠（P < 0.05），见图5B。

给药后，对比巨噬细胞比例发现：成年鼠在给药第3天，巨噬细胞比例骤降至（20.9±8.9）%，至第28天可恢复至正常值。幼年鼠变化趋势与成年鼠类似。老年鼠在给药后第3天骤降至（14.8±6.6）%，至第28天回落到（56.1±26.3）%，变化趋势与成年鼠相同。见图5C。

给药后，对比CD4+T细胞绝对数发现：成年鼠在给药第3天，CD4+T细胞比例骤降至（4.0±2.3）%，至第7天即可恢复正常值范围。幼年鼠在给药第3天下降至（30.4±16.2）%，第14天可恢复正常值范围，恢复能力弱于成年鼠（P < 0.05）。老年鼠在给药第3天，骤降至（1.6±0.4）%，至第28天恢复至（63.7±14.3）%，恢复情况弱于成年鼠（P < 0.05）。见图5D。

给药后，对比CD8+T细胞绝对数发现：成年鼠在给药第3天，CD8+T细胞比例骤降至（3.6±2.8）%，至第28天可恢复至正常值。幼年鼠在给药后第3天，下降至（20.9±9.8）%，趋势与成年鼠不同（P < 0.05），第7天可恢复至（39.9±7.1）%，第28天恢复情况与成年鼠类似。老年鼠在给药后第3天，骤降至（3.9±1.0）%，至第7天可恢复至（83.3±11.0）%，第28天恢复情况与成年鼠类似。见图5E。

2.6 环磷酰胺对不同年龄小鼠血浆IgA、IgG、IgM含量的影响

给药后，对比血浆IgA含量发现：成年鼠在给药后第3天，IgA含量下降至（6.7±3.0）%，至第28天可恢复至（83.3±9.8）%。幼年鼠在给药后第3天，下降至（62.6±4.4）%且至第28天可完全恢复。损伤恢复趋势优于成年鼠（P < 0.05）。老年鼠变化趋势与成年鼠基本一致。见图6A。

给药后，对比血浆IgG含量发现：成年鼠在给药后第3天，IgG含量骤降至（4.5±0.7）%，且第28天只能恢复至原来的（50.2±8.3）%。幼年鼠在给药后第7天，下降至（38.9±7.5）%，至第14天即可完全恢复，恢复情况优于成年鼠（P < 0.05）。老年鼠损伤恢复情况与幼年鼠相似。见图6B。

给药后，对比血浆IgM含量发现：成年鼠在给药后第3天，IgG含量降至（37.0±4.9）%，至第28天可完全恢复。幼年鼠、老年鼠变化情况与成年鼠基本一致。见图6C。

3 讨论

儿童处于免疫功能不全期，自身免疫系统发育还未成熟，免疫系统较易受到攻击。在一些疾病的急性期，常发生免疫细胞紊乱，引起继发感染[4]。随着年龄的增长，人体免疫系统功能将逐渐衰退。免疫功能不足对老年人的健康产生极为不利的影响[10]。目前，许多老年人易感的疾病需要长期用药，部分药物会产生免疫系统损伤的毒副作用[11]，老年人在长期应用这类药物后，相较成年人，对损伤会更敏感且恢复更缓慢。

胞数均在第3天降低。从模型上讲，应用环磷酰胺后，幼年鼠免疫系统变化情况与成年鼠基本一致；老年鼠免疫系统功能明显下降，表现在脾脏指数、外周血白细胞数、中性粒细胞比例、NK细胞、CD4+T细胞、B细胞损伤更严重或预后较差。这与已报道的研究结果一致[12-15]。提示在应用免疫抑制类药物时，儿童免疫系统受影响程度较小，老年人免疫系统表现更为敏感。从机制上讲，上述细胞的功能涉及非特异性免疫、特异性免疫、免疫平衡等方面，儿童、老人和成人在特异性免疫、非特异性免疫方面的反应性差别已有较多研究[16-17]。在以往研究中，环磷酰胺常用作免疫抑制剂，利用成年鼠评价免疫保护类、免疫调节类药物的作用，但评价体系较为单一[18-19]。本研究旨在全面地评价不同年龄小鼠的免疫系统损伤的具体差异，为临床合理用药提供指导。

随着年龄的增长，人的免疫功能经历了从建立到成熟到退化的过程[20]。关于免疫抑制剂对幼年鼠、老年鼠免疫系统的抑制作用，停药后的恢复情况以及与成年鼠相关指标的差别鲜有报道。本研究以环磷酰胺为阳性药物，旨在全面系統地比较幼年鼠、老年鼠与成年鼠免疫系统的具体差别。为日后评价对儿童、老人免疫系统有损伤作用的药物提供基础数据。本研究亦对比了幼年、成年、老年鼠外周血、胸腺、脾脏免疫细胞应用免疫抑制剂造模后的参数变化，为儿童、老人应用对免疫系统有调节作用的药物时提供参考。

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（收稿日期：2016-09-06 本文编辑：程 铭）