EGCG调节PI3K/AKT信号通路保护肾功能的机制研究

李易　叶曦

[摘要] 目的 探討表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对糖尿病肾病（DN）大鼠的保护作用。 方法 48只雄性SD大鼠随机分为三组，每组16只。Control组给予正常饮食，DN组采用高脂饮食联合链脲佐菌素（STZ）50 mg/kg腹腔注射建立DN模型，EGCG组给予EGCG 50 mg/kg每天灌胃治疗，同DN组大鼠予以相同体积生理盐水。分别在6周和12周处死大鼠各半，收集血清和肾脏，采用ELISA、RT-qPCR和Western blot等方法检测相关因子。 结果 与Control组比较，DN组血清中肾功能指标、炎症因子以及血脂水平升高（P < 0.05），EGCG治疗6周后，与DN组比较，EGCG组上述指标下降（P < 0.05）；与Control组比较，DN组大鼠血清中抗氧化因子含量降低（P < 0.05），治疗6周后，与DN组比较，EGCG组上述指标升高（P < 0.05）；与Control组比较，DN组大鼠肾脏组织中p-PI3K和p-AKT的蛋白表达下调（P < 0.05），治疗6周后，与DN组比较，EGCG组p-PI3K和p-AKT的蛋白表达水平上调（P < 0.05），治疗12周后上述指标进一步改善。结论 EGCG可通过减少体内炎症反应与脂质沉积，改善肾功能、增加抗氧化能力以及抗细胞凋亡等途径治疗DN大鼠肾脏损伤。

[关键词] 表没食子儿茶素没食子酸酯；糖尿病肾病；磷脂酰肌醇-3-激酶；丝苏氨酸蛋白激酶

[中图分类号] R587 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（c）-0031-05

[Abstract] Objective To explore the protective effect of EGCG on diabetic DN rats. Methods 48 male SD rats were divided into 3 groups respectively， each group had 16 rats. Rats in the control group were given normal diet， while rats in the other groups were fed with a high-fat diet accompanied with intraperitoneal injection of STZ （50 mg/kg） to establish DN model. Then the rats in the EGCG group were given EGCG （50 mg/kg） by lavage every day， at the same time the DN group were given the same volume of saline. Half of the rats in each group were killed at 6 or 12 weeks respectively， the serum and kidney tissues were collected. The related factors were determined by ELISA， RT-qPCR and Western blot. Results Compared with the control group， the concentrations of indicaters of renal function， inflammatory and lipids in the DN group were increased （P < 0.05）， after EGCG treatment for 6 weeks， compared with the DN group， these indexes in the EGCG group were decreased （P < 0.05）. Compared with the control group， the contents of anti-oxdators in the DN group were reduced （P < 0.05）， after EGCG treatment for 6 weeks， compared with the DN group， these parameters in the EGCG group were elevated （P < 0.05）. Compared with the control group， the protein expression levels of p-PI3K and p-AKT in kidney tissues of the DN group were downregulated， after treatment with EGCG for 6 weeks， compared with the DN group， those in the EGCG group were upregulated （P < 0.05）， while after EGCG treatment for 12 weeks， the improve effects above became more obvious. Conclusion EGCG may ameliorate the kidney injury by reducing inflammation and lipids deposition， improving the renal function， increasing the ability of anti-oxidation and anti-apoptosis in DN rats.

[Key words] Epigallocatechin-3-gallate； Diabetic nephropathy； Phosphatidylinositol 3-kinases； Serine-threonine kinase

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是以代谢紊乱为主要特点的内分泌障碍疾病，胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是其发病的原因[1]，其中，糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是最常见的DM外周血管并发症[2-4]。近年来，由DN引起的终末期肾脏疾病的发生率不断升高[5-6]。大量文献报道磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（phosphatidylinositol 3-kinase/serine-threonine kinase，PI3K/AKT）信号通路与细胞凋亡发生发展相关[7-9]，因此对PI3K/AKT信号通路的调控可能是治疗DN的新靶点。本实验旨在研究表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）[10-12]对高脂饮食加链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的DN大鼠模型中PI3K/AKT信号通路的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 48只体重180～200 g雄性SD大鼠[合格证号：SYXK（滇）2011-0004]，由昆明医科大学动物实验动物学部提供。

1.1.2 药品与试剂 EGCG（美国Apexbio公司），STZ（美国Sigma公司），葡萄糖（Glucose）等测定试剂盒（Bio-Swamp公司），ELISA试剂盒（南京建成），抗体（美国Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 DN大鼠模型的建立 大鼠隨机分为正常对照（Control）组（n =16）、DN组（n =16）以及EGCG组（n =16）。Control组给予普通饲料喂养，DN组和EGCG组给予高脂饲料喂养，4周后，采用STZ溶液（50 mg/kg）腹腔注射造模。EGCG组给予EGCG 50 mg/kg每天灌胃治疗，同时DN组予以相同体积生理盐水灌胃，分别在6周和12周时处死大鼠各半。

1.2.2 标本采集 大鼠腹腔注射3.6%水合氯醛麻醉，5000 r/min离心15 min，获得血清。取血完成后处死大鼠，取肾脏组织冷藏。

1.2.3 相关生化指标检测 相关生化指标采用ELISA试剂盒检测。

1.2.4 RT-qPCR检测 PCR扩增反应条件如下：95℃预变性2 min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸35 s，循环次数40次；72℃最后再延伸5 min。引物序列为：PI3K正向：5'-CACCTTAAATGGTGAGCACGG-3'，反向：5'-ACACCCCAGCCAATCAAGTC-3'；AKT正向：5'-CCGCCTGATCAAGTTCTCCT-3'，反向：5'-TTCAGATGATCCATGCGGGG-3'。

1.2.5 Western blot检测 取肾脏组织约100 mg匀浆，进行SDS-PAGE电泳，转膜，加入一抗（1∶2000），4℃过夜，孵育二抗（1∶4000），以GAPDH作为内参，每组实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组不同时间肾功能指标比较

DN组大鼠血清中Scr、BUN、CysC以及RBP含量均明显高于Control组（P < 0.05）；EGCG治疗后，上述指标较DN组明显下降（P < 0.05），治疗12周后下降效果更加显著（P < 0.05）。

2.2 三组不同时间血糖及胰岛素水平比较

与Control组比较，在DN组大鼠血清中，血糖、胰岛素的含量以及胰岛素抵抗指数都明显升高（P < 0.05）；经EGCG灌胃治疗后，各项指标均较DN组下降明显（P < 0.05），且治疗12周比治疗6周效果更加明显（P < 0.05）。

2.3 三组不同时间氧化和抗氧化指标比较

与Control组比较，DN组MDA含量升高明显（P < 0.05），经EGCG治疗后MDA含量较DN组降低（P < 0.05）；与Control组比较，DN组SOD和GSH含量下降（P < 0.05），经EGCG治疗后SOD和GSH含量较DN组增多（P < 0.05）；且EGCG组各项指标治疗12周均比治疗6周变化明显，但差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.4 三组不同时间炎症因子比较

与Control组比较，DN组TNF-α、IL-1β和IL-6含量增加明显（P < 0.05）；经EGCG治疗后，各项指标均较DN组下降明显（P < 0.05），且治疗12周比治疗6周下降更加显著（P < 0.05）。

2.5 三组不同时间血脂指标比较

与Control组相比，DN组TC、TG和LDL-C水平升高（P < 0.05）；EGCG治疗后，TC、TG和LDL-C水平较DN组降低（P < 0.05），且治疗12周治疗的效果比6周更加明显，但差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.6 三组不同时间肾脏PI3K和AKT mRNA表达比较

PI3K和AKT mRNA水平在各组大鼠肾脏组织中的表达变化不明显，差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.7 三组不同时间肾脏PI3K和AKT的蛋白表达以及磷酸化程度比较

与Control组相比，DN组p-PI3K和p-AKT的表达水平显著降低（P < 0.05），EGCG治疗后，p-PI3K和p-AKT的表达水平较DN组升高（P < 0.05），且治疗12周比6周升高更加明显，但差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2。

3 讨论

现代药理学证实，儿茶素具有降血糖、抗氧化与增强胰岛素敏感性的作用[13]。研究表明，EGCG能够抑制肾小球系膜细胞增殖，保护肾功能[14]。本实验结果证实：EGCG能够降低DN大鼠血液中的Scr、BUN、CysC以及RBP的含量，并且通过对大鼠炎症、血脂、氧化和抗氧化等指标的检测显示，EGCG具有减轻

DN大鼠体内IR、炎症反应以及脂质沉积，增强抗氧化能力的作用。近年来许多关于DN发生的分子机制研究认为，肾功能的损害与细胞凋亡过程调节异常密切相关，其中，PI3K/AKT信号通路是保护肾脏细胞、抑制细胞凋亡的重要信号通路[15-19]。文献报道，PI3K/Akt通路不仅是药物保护肾脏细胞重要作用靶点，也是抑制细胞凋亡的上游通路，通过对PI3K/Akt信号通路磷酸化的激活可以抑制细胞凋亡[20]。本实验通过Western blot检测发现，EGCG能明显激活PI3K/AKT信号通路，增加PI3K和AKT的磷酸化，以达到对肾脏细胞的保护作用。

综上所述，EGCG可降低DN大鼠体内炎症反应与脂质沉积，改善肾功能以及增加抗氧化能力并且可能通过上调PI3K/AKT信号通路的磷酸化程度而发挥减轻和延缓DN大鼠肾损伤。

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（收稿日期：2016-09-11 本文编辑：程 铭）