高危型HPV—18E6引起小鼠骨髓源性树突细胞p53的磷酸化

孙丽娜　韦超　吉兴照

[摘要] 目的 探讨高危型HPV-18E6对树突细胞中p53蛋白磷酸化的作用。 方法 构建真核表达载体pGFP-18E6，转染小鼠骨髓源性的树突细胞，采用磷酸化的p53抗体免疫荧光化学染色，共聚焦显微镜下动态观察其表达水平。选用p53磷酸化位点的抗体（包括Ser6、Ser9、Ser15、Ser20、Ser37、Ser46和Ser392）对GFP-18E6融合蛋白表达的细胞进行免疫细胞化学染色，进一步探讨磷酸化的p53蛋白在转染后12～72 h的动态表达水平。 结果 树突细胞在转染pGFP-18E6和pEGFP-C1质粒后，GFP-18E6主要定位于细胞核内，而对照组只表达GFP的蛋白则均匀分布于树突细胞。GFP-18E6诱导了p53蛋白的Ser15、Ser20和Ser392三个位点磷酸化。激光共聚焦显微镜测量细胞荧光强度显示，GFP-18E6的表达与时间有相关性。 结论 高危型HPV-18E6可以诱导树突细胞的p53蛋白发生多个位点的磷酸化，包括Ser15、Ser20和Ser392，p53多个位点磷酸化是病毒宿主相互作用的一种机制。

[关键词] HPV18-E6；树突细胞；p53磷酸化；定位

[中图分类号] R373.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（c）-0022-04

[Abstract] Objective To study the effect of p53 phosphorylation in high-risk HPV-18E6 expressed bone marrowed dendritic cells. Methods The eukaryotic expression vector pGFP-18E6 was constructed and transfected into mouse bone marrow derived dendritic cells. The expression level of p53 was detected by immunofluorescence staining under the confocal microscope. Antibodies to p53 phosphorylation sites （including Ser6， Ser9， Ser15， Ser20， Ser37， Ser46， and Ser392） were used for immunocytochemical staining of cells expressing GFP-18E6 fusion protein， the phosphorylation of p53 protein after transfection in 12-72 h dynamic expression was further investigated. Results Dendritic cells transfected with pGFP-18E6 and pEGFP-C1 plasmid， GFP-18E6 was localized in the nucleus， while in the control group， the expression of GFP protein was uniformly distributed in the dendritic cells. GFP-18E6 induced phosphorylation of Ser15， Ser20 and Ser392 in three sites of p53 protein. The fluorescence intensity of the cells measured by confocal microscopy showed that the expression of GFP-18E6 was correlated with the time. Conclusion The high risk HPV-18E6 can induce the p53 phosphorylation mainly located in nucleic in dendritic cells， including Ser15， Ser20 and Ser392. It may be one of the way that virus interact with host cells.

[Key words] HPV-18E6； Dendritic cells； p53 phosphorylation； Location

人類乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）可引起人的多种皮肤和黏膜的上皮增生性病变，根据HPV引起的病变性质，其被分为高危型（high risk，HR）和低危型（low risk，LR）两种。高危型HPV如HPV-16和HPV-18可以引起宫颈癌，而低危型HPV-11和HPV-6只引起生殖道的良性增生或尖锐湿疣（condyloma acuminatum，CA）[1-2]。长期以来人们对高危型HPV的致癌机制进行了许多深入的探讨，发现高危型HPV的E6蛋白是引起恶性转化的主要原因。p53是重要的抗癌蛋白，在DNA损伤应激的作用下可以被活化[3-5]。近年来，p53的磷酸化逐渐成为研究的热点，已经表明其在活化p53的功能上发挥了重要作用。目前发现了p53至少有20个磷酸化的位点，它们可以通过不同的信号途径来发挥作用[7-10]。那么高危型HPV-18E6是否会影响p53的磷酸化？本研究采用绿色荧光蛋白转染系统，在小鼠骨髓来源的树突细胞中表达全长的高危型HPV-18E6蛋白，以探讨其对树突细胞p53磷酸化的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

真核表达载体pEGFP-C1购自Clonetech公司；含有全长HPV-18E6基因序列的載体pCMV/HPV-18E6来自本实验室；质粒大量提取试剂盒为QIAGEN产品，限制性内切酶BglⅡ、EcoRⅠ，T4 DNA ligase、Taq酶等均购自Takara公司；转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 树突细胞培养 脱颈处死C57BL/6小鼠，用75%乙醇浸泡5 min，无菌剥离股骨、胫骨及肱骨，去除附着肌肉，剪去骨骺两端，用注射器反复冲洗骨髓腔，离心收集骨髓细胞，加入37℃预热的Tris-NH4Cl裂解红细胞，PBS洗涤2次，加入IL-4（500 μg/mL） 和GM-CSF（800 μg/mL），经流式细胞仪检测表面标记分子证实为树突细胞。用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液调整细胞密度至3×109 个/mL，接种于6孔板中，于37℃，5%CO2孵箱中培养，弃去悬浮细胞，加入新鲜的完全培养基并补充相同浓度的细胞因子，隔日半量换液，每日在相差显微镜下观察树突细胞的形态。

1.2.2 真核表达质粒构建及细胞瞬时转染 以pCMV/HPV-18E6为模板，以E6基因片段两端分别引入BglⅡ和EcoRⅠ酶切位点的引物行PCR扩增，反应条件为95℃预变性5 min，94℃ 50 s，61℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃延伸10 min，获得HPV-18E6的基因片断，利用T4 DNA ligase经4℃过夜，插入pEGFP-C1表达载体，连接好的重组体进行BglⅡ和EcoRⅠ双酶切鉴定正确，并经测序与Genebank中的序列完全一致，重组表达质粒命名为pGFP-18E6，按QIAGEN公司试剂盒说明书进行质粒大量提取与纯化。树突细胞培养至第5天时进行转染，转染按照Invitrogen公司Lipofectamine2000转染试剂盒说明书进行[11]。

1.2.3 共聚焦显微镜观察 树突细胞在转染pGFP-18E6和pEGFP-C1质粒后的24 h取出细胞爬片，用4%多聚甲醛固定，室温10 min，冰冷的PBS洗3次，细胞核用PI染色，避光，10 min，用荧光显微镜采集图像，观察E6蛋白在树突细胞中的定位情况。

1.2.4 免疫荧光技术检测p53蛋白及磷酸化p53的表达 分别将pGFP和pGFP-18E6转染树突细胞后，取出24孔培养板中的细胞爬片，生理盐水洗3次，每次5 min，用4%的多聚甲醛室温固定7 min，置于空气中干燥。1×PBS洗涤3次，每次约5 min。滴加蛋白封闭液，置于37℃湿盒中，封闭30 min。吸去封闭液，在细胞表面分别滴加入p53抗体和磷酸化p53抗体（cell signaling，1∶500稀释），4℃，湿盒中过夜。次日，1×PBS-T洗涤3次，每次5 min。滴加Cy3标记的羊抗兔二抗（santa cruz，1∶500稀释），注意避光，37℃，湿盒中作用40～60 min。采用1×PBS-T洗涤3次，每次5 min。PBS封片，激光共聚焦显微镜下观察结果，拍照。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示，各组间比较采用oneway ANOVA，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GFP-18E6融合蛋白在细胞中的定位

将转染后的树突细胞用4%的多聚甲醛固定，室温，7 min，GFP发出绿色的荧光，可以清晰地看到蛋白的定位。结果可见细胞中GFP-18E6（GFP与HPV-18E6的融合蛋白）主要定位于细胞核内，而对照GFP蛋白则分布于整个细胞中。

2.2 GFP-18E6融合蛋白与磷酸化的p53共定位于细胞核

选用不同的p53磷酸化位点的抗体（包括Ser6，Ser9，Ser15，Ser20，Ser37，Ser46和Ser392）对GFP-11E6融合蛋白表达的细胞进行免疫细胞化学染色，结果显示，Ser15，Ser20和Ser392三个位点磷酸化的p53蛋白呈现红色的荧光，因此，GFP-18E6蛋白可以引起p53多个位点磷酸化，包括Ser15，Ser20和Ser392，并且磷酸化的p53蛋白均主要表达于细胞核内。进一步通过计算机图像Merge处理可以很清晰的看到发出红色荧光的磷酸化p53与绿色荧光的GFP-18E6蛋白共定位于细胞核。见图1（封四）。

2.3 磷酸化p53的表达水平与时间的关系

由于GFP-18E6的表达与时间有相关性，进一步探讨磷酸化的p53蛋白转染后的12～72 h的动态表达水平。激光共聚焦显微镜测量细胞荧光强度显示，在GFP-18E6转染后的12 h，树突细胞中Ser15和Ser20的p53蛋白表达阳性，并且它们的表达逐渐增高，在24 h表达到高峰。另外，在相同时间点观察到Ser15的表达明显高于Ser392和Ser20的p53的水平，且Ser392明显高于Ser20的水平，差异有统计学意义（P < 0.05）。转染后的48～72 h，这三个位点磷酸化的p53蛋白均为阴性。对于只表达GFP的对照组细胞，在整个观察期间均未见到p53的磷酸化表达。见图2。

3 讨论

目前发现，p53至少有20个磷酸化的位点，它们可以通过不同的信号途径来发挥作用。如，在p53的N端的磷酸化位点（Ser6、Ser9、Ser15、Ser20、Ser33和Ser37）可以增强与转录活化因子p300/CBP和PCAF的相互作用[12]。且已有研究表明，Ser15、Ser20和Ser37可以稳定p53。而C末端磷酸化的Ser315和Ser392位点以序列特异性结合的方式来调节p53的寡聚化状态。磷酸化能够稳定并且活化p53，主要是由p53的Ser15和Ser20的磷酸化引起的。当细胞受到DNA损伤的刺激时，ATM能迅速磷酸化p53的Ser15位点，抑制p53与MDM2的相互作用，从而来稳定p53。p53的Ser20位于p53与MDM2相互作用的α-螺旋内，其磷酸化可抑制p53的泛素化降解。在应激的刺激中，p53的Ser20位点被细胞周期检查点激酶2（Chk2）等激酶磷酸化，迅速提高了p53在细胞内的总蛋白质水平。对转基因小鼠的研究表明，当p53的Ser15和Ser20位点都突变成丙氨酸时，将严重削弱p53依赖的细胞凋亡及肿瘤抑制效应[13]。这一发现有力地证明了p53的Ser15和Ser20的磷酸化对p53生理功能的重要性。

本研究构建了真核HPV-18E6蛋白表达系统，观察到HPV-18E6主要表達于细胞核中，且随着时间的延长，进入细胞核的p53逐渐增加。由于p53的磷酸化是抗病毒的主要机制之一，因此在HPV-18E6蛋白表达的背景下来探讨p53的磷酸化状态。观察到HPV-18E6瞬时表达的细胞中，p53在Ser15、Ser20和Ser392位点出现了明显的磷酸化，并且它们主要位于细胞核中。因此，结果表明HPV-18E6可以诱导p53多个位点的磷酸化。其中，Ser15和Ser20位点最先发生磷酸化，与此相一致的是，曾经有报道认为，Ser15在DNA损伤的事件中是最早发生磷酸化的位点，由ATM/ATR诱导的Ser15位点的磷酸化可以使p53和MDM2解离，因此，p53在Ser15的磷酸化可以使p53的表达水平增加[14]。另外，已有研究证实，Ser20的磷酸化在稳定p53功能时也发挥了重要的作用，Ser20的磷酸化是由Chk1和Chk2介导的，它增加了p53的四聚体化、稳定性及对抗DNA损伤的能力[15]。现已知Ser15和Ser20的磷酸化位点恰好在MDM2结合的位置上，因此可以打断p53与MDM2的结合，从而导致p53的稳定性增加[16]。

本研究发现，p53在Ser15位点的磷酸化明显高于Ser20位点的磷酸化，对于HPV-18E6来说，可能磷酸化的Ser15位点比Ser20位点发挥了更大的作用。这与已经证实的结果去除Ser15位点的磷酸化可以废除Ser20位点的磷酸化相符合。以前的研究发现，在不同的DNA损伤的应激下可以引起不同位点的p53磷酸化。其中，Ser15是发现的第一个磷酸化位点，它在γ放射线的刺激下可以通过DNA依赖的PK和ATM蛋白来磷酸化p53，并且抑制MDM2对p53的降解。类似的，Ser20的磷酸化，也是在γ放射线的作用下可以解离p53与MDM2的作用，从而来稳定p53的功能[14]。另外，在紫外线的照射下，可以引起酪氨酸激酶依赖的p53磷酸化，其位点是在p53C末端的Ser392[17]。因此，目前的研究表明，在DNA损伤的应激下，p53的磷酸化在调节p53的功能上发挥重要作用。在另一方面，细胞将病毒的感染视为DNA损伤的刺激，启动了宿主的监视防御机制来对抗病毒的感染，其中，调节p53的磷酸化功能是一个主要的抗病毒的途径。非洲黄热病毒（African swine fever virus，ASFV）是通过Ser392的磷酸化来稳定p53的功能，磷酸化的p53可以诱导细胞凋亡[18]。EB（Epstein Barr）病毒是通过Ser15，Ser20和Ser392位点的磷酸化来活化p53蛋白，并通过促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的活化靶向作用于抗病毒的转录因子[19]。相对应的，病毒也进化了一些策略通过减少p53的磷酸化来对抗p53的活化。如，卡波氏肉瘤相关病毒（Kaposi Sarcoma Associated Herpesvirus，KSHV）的干扰素调节因子（vIRF1）能极大地降低p53在Ser15的磷酸化水平，导致p53的泛素化降解，从而屏蔽掉宿主的监视机制，有利于病毒在宿主细胞中的复制[20]。因此，本研究推断，在HPV-18E6的作用下，细胞内p53发生了磷酸化，p53多个位点磷酸化是病毒宿主相互作用的一种机制。

综上所述，HPV-18E6转染小鼠骨髓源性树突细胞后，可以引起细胞内p53在多个位点的磷酸化，这可能是病毒宿主相互作用的一种机制。

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（收稿日期：2016-09-15 本文編辑：王红双）