雷利度胺抗胃癌细胞作用及机制研究

李红玲　张玲芳　李明玉

[摘要] 目的 探讨雷利度胺对胃癌MFC细胞体外增殖与凋亡的影响及其作用机制。 方法 以MTT法检测雷利度胺对MFC细胞增殖的影响，荧光显微镜观察雷利度胺作用后MFC细胞形态的变化，流式细胞仪检测雷利度胺作用后MFC凋亡率，Western blot分析凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3表达。 结果 雷利度胺能显著抑制MFC细胞的增殖，呈现出剂量效应及时间效应趋势。雷利度胺作用MFC细胞后呈现典型细胞凋亡的形态学改变、凋亡增加。与对照组比较，60 mg/L雷利度胺诱导72 h组及120 mg/雷利度胺诱导72 h组的细胞可以明显抑制MFC细胞的生长（P < 0.01）。与对照组比较，雷利度胺作用后Bcl-2表达明显下降（P < 0.01），Cleaved Caspase-3表达有所增加（P < 0.05）。 结论 雷利度胺可抑制MFC细胞增殖、促进细胞凋亡，其机制可能与激活Caspase-3、下调Bcl-2表达有关。

[关键词] 雷利度胺；MFC细胞；增殖；凋亡

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（c）-0018-04

[Abstract] Objective To explore the effects of Lenalidomide on gastric carcinoma MFC cells proliferation and apoptosis in vitro and its mechanism. Methods The inhibitory effect of Lenalidomide on MFC cells was estimated by MTT assay， and the morphological changes of the cells were observed under fluorescence microscope. Cell apoptosis were analyzed using flow cytometry. The protein expressions of apoptosis-associated genes as Bcl-2 and Caspase-3 were viewed by Western blot. Results Proliferation of MFC cells was inhibited effectively after treated with Lenalidomide. Lenalidomide inhibited the proliferation of MFC cells in a time- and dose-dependent manner. Lenalidomide treatment resulted in changes of apoptotic morphology of the cells as observed under fluorescence microscope and increased cell apoptosis. Compared with control group， 60 mg/L Lenalidomide group and 120 mg/L Lenalidomide group can significantly inhibit the growth of MFC cells after treatment of 72 hours （P < 0.01）. Compared with control group， the expression of Bcl-2 was significantly decreased after Lenalidomide （P < 0.01）， the expression of Cleaved Caspase-3 was increased after Lenalidomide （P < 0.05）. Conclusion Lenalidomide can inhibit MFC cell proliferation， induce cell apoptosis， and the mechanism may be correlated to the up-regulation of Caspase-3 and down-regulation of Bcl-2.

[Key words] Lenalidomide； MFC cell； Proliferation； Apoptosis

雷利度胺是沙利度胺的類似物，最早用于多发性骨髓瘤[1]的治疗，目前在套细胞淋巴瘤[2-3]和骨髓增生异常综合征的治疗中也取得较好的效果，且不良反应轻微。研究发现，雷利度胺对某些实体瘤[4]也有抗肿瘤作用，如在非小细胞肺癌[5]的研究中也发现其抗肿瘤作用。但雷利度胺是否对胃癌有抗肿瘤作用目前未知。本研究采用胃癌细胞株MFC作为研究对象，应用细胞毒性、流式细胞仪凋亡检测等方法，观察雷利度胺对MFC细胞体外抗增殖与诱导凋亡的作用，并初步探讨其机制。旨在为雷利度胺在胃癌治疗中的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

雷利度胺购自台州市椒江星成医药化工有限公司，用二甲基亚砜（DMSO）配制成20 mg/mL的储存液，-20℃冻存，临用时稀释至工作浓度，其中DMSO的使用浓度低于1%。0.1%胰蛋白酶、PMI1640培养基购自Gibco公司；Hoechst33258、Annexin V试剂盒为杭州碧云天生物技术有限公司产品；四甲基偶氮唑盐（MTT）（250 mg/支）为Sigma公司；Bcl-2、Caspase-3、Cleaved Caspase-3抗体购自Santa-Cruz公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞培养

细胞系为鼠胃癌细胞株MFC，购自中国科学院上海细胞库。细胞培养、传代细胞于含10%小牛血清的RPMI1640完全培养基中，常规加入100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素于培养基，在37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱培养。0.1%胰蛋白酶消化传代。实验均采用对数生长期细胞。

1.3 MTT法检测雷利度胺对MFC细胞增殖的抑制作用

取对数生长期的细胞，0.1%胰蛋白酶消化，每孔加200 μL细胞悬液并接种于96孔培养板中。在预实验中发现低浓度雷利度胺（1.25、2.5、5、10 mg/L）对MFC细胞无明显抑制作用，故本研究中选择雷利度胺浓度为20、40、60、80、100、120 mg/L。各组均按每孔5×104/mL细胞数接种96孔板，每组设4复孔，同时设置空白对照组、溶剂对照组和调零孔。细胞贴壁后加入不同浓度雷利度胺，使其终浓度分别为20、40、60、80、100、120 mg/L。培养24、48、72、96 h后，加20 μL/孔MTT，继续培养4 h弃上清液，加入150 μL/孔DMSO。为使结晶充分溶解需先震荡10 min，采用自动酶标仪测570 nm波长处吸光度（A）值。细胞抑制率=（1-A570处理组/A570未处理组）×100%。

1.4 Hoechst33258染色荧光显微镜观察雷利度胺对MFC细胞形态的影响

实验分组：对照组，60 mg/L雷利度胺诱导72 h组，120 mg/L雷利度胺诱导72 h组。对数生长期的细胞消化成单细胞悬液，消毒盖玻片后放入6孔板中，细胞接种浓度为5×104/mL。48 h后取出贴有细胞的盖玻片，PBS冲洗3次，对照组细胞只加培养液孵育48 h，按照Hoechst33258染色试剂盒说明书进行染色，荧光显微镜下观察细胞形态学变化。

1.5 Annexin Ⅴ染色流式细胞术检测细胞凋亡率

收集对照组，60、120 mg/L雷利度胺诱导72 h的细胞，用冰冷PBS洗涤两遍，应用缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为5×105细胞，生理盐水洗涤2遍，加5 μL Annexin Ⅴ-FITC混匀避光作用30 min，加入10 μL PI室温避光作用15 min，流式细胞仪（FASCalibur）在488 nm激发波长处进行凋亡率检测。

1.6 Western blot分析Bcl-2、Caspase-3表达

制备细胞抽提液。取1.0 μL测定蛋白质浓度，SDS-聚丙酰胺凝胶浓度为15%。上样前每份标本取50 μg蛋白质与2×上样缓冲液混匀后，100℃煮沸3 min。电泳完成后用硝酸纤维素膜上进行电转移，用5%脱脂牛奶封闭，Bcl-2（1∶1000）、Caspase-3（1∶500）、Cleaved Caspase-3（1∶500）室温杂交2 h。二抗室温杂交45 min，ECL显像。

1.7 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法测定雷利度胺对MFC的细胞毒性

20、40、60、80、100、120 mg/L雷利度胺分别诱导MFC细胞0～96 h，分别以雷利度胺作用浓度及时间为横坐标，细胞抑制率为纵坐标绘制曲线作图1，可见细胞抑制率随雷利度胺作用浓度的增加而逐渐增加，随雷利度胺作用时间的延长而增加，显示了雷利度胺抑制作用的时间依赖性和浓度依赖性特点。72 h细胞IC50为60 mg/L，因此选用60 mg/L作为后续实验剂量。

2.2 Hoechst33258染色荧光显微镜观察雷利度胺对MFC作用后细胞形态的改变

雷利度胺作用后可见MFC细胞形态出现了明显的改变。Hoechst33258染色荧光显微镜下观察可见，正常细胞的细胞核染色均匀，细胞核接近圆形，染色均匀而明亮。雷利度胺处理后，细胞核发生形态学改变，染色质断裂、浓缩，细胞核裂解为碎块，在荧光显微镜下表现为发强蓝色荧光的团块或颗粒，部分染色呈弥散分布，部分细胞核碎裂成明亮的块状（图2），提示MFC细胞核损伤为雷利度胺引起的凋亡改变。

2.3 雷利度胺对MFC细胞凋亡的影响

图3所示MFC细胞凋亡率随雷利度胺浓度的增加而增加，在MFC细胞中对照组、60 mg/L雷利度胺誘导72 h组及120 mg/L雷利度胺诱导72 h组的细胞凋亡率分别为0.24%、16.06%和29.75 %，显示了剂量依赖性特点，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。

2.4 雷利度胺对BGC-823、MFC细胞Bcl-2、Caspase-3表达的影响

Western blot结果如图4所示，雷利度胺作用后Bcl-2、Cleaved Caspase-3的表达发生了显著变化，前者较对照组明显降低（P < 0.01），后者则明显升高（P < 0.05），且上述变化与雷利度胺呈剂量依赖关系。

3 讨论

胃癌为我国高发肿瘤之一[6]，手术、化疗、放疗是其传统的治疗方法，对于晚期胃癌而言，化疗是最重要的治疗手段之一[7-8]，然而一线的化疗有效率仍然徘徊在30%～40%，PFS在4～6个月，总生存期不超过1年[9]，因此很有必要研究新的治疗策略。

雷利度胺是一种免疫调节药，该药被FDA首先批准用于恶性血液病的治疗，如多发性骨髓瘤[10]及骨髓增生异常综合征[11]，且疗效肯定，其抗肿瘤机制包括直接细胞毒性、对肿瘤免疫的间接调节作用、诱导肿瘤细胞凋亡、抗肿瘤组织血管生成、抑制由细胞因子和骨髓基质细胞介导的肿瘤细胞抗药性的产生等作用。近几年随其应用的扩大，有临床研究逐步推广应用于血液系统其他肿瘤及部分实体瘤中，已有研究显示部分非霍奇金淋巴瘤[12-13]、复发难治的霍奇金淋巴瘤[14]、老年急性髓系白血病及初治的慢性淋巴细胞白血病患者[15]在疗效方面获得临床缓解，不良反应小、可控。

本研究以雷利度胺诱导的胃癌细胞MFC为模型探讨雷利度胺诱导胃癌细胞死亡的方式及分子机制。采用MTT法证实了对MFC细胞的增殖有明显抑制作用。从MTT的实验结果看，20～40 mg/L的雷利度胺对MFC-7细胞的增殖抑制作用不明显，而60 mg/L及更高浓度的雷利度胺则可使细胞增殖受到明显抑制，且伴随着药物作用浓度的增高和作用时间的延长，细胞增殖被抑制更为明显，根据生长曲线计算，雷利度胺对MFC细胞的半数有效量在72 h时为60 mg/L。提示雷利度胺对MFC细胞的增殖有抑制作用，而且呈时间和浓度依赖性。

Hoechst33258是一种能够于细胞染色质结合的无毒、水溶性双苯咪唑类化合物，能够与细胞内的DNA分子结合，在荧光显微镜下可观察到细胞核是否受损。本实验结果显示，浓度为60、120 mg/L的雷利度胺作用MFC细胞72 h后，部分染色质的染色增强，说明雷利度胺可以引起MFC细胞发生凋亡。本实验还通过流式细胞仪检测处理组与对照组细胞凋亡百分比，60、120 mg/L雷利度胺分别作用MFC细胞72 h后检测发现，在雷利度胺浓度60 mg/L时即有较高的细胞凋亡发生，伴随雷利度胺药物浓度的增加，细胞凋亡率逐渐上升，药物浓度在120 mg/L时，凋亡率达到29.75%。以上证明雷利度胺具有抗胃癌细胞增殖和诱导凋亡的作用，且这一作用与药物作用的浓度有相关性。

细胞凋亡在肿瘤发生过程中起着非常重要的作用[16]，其中Caspase蛋白家族、Bcl-2蛋白家族等在调控凋亡信号转导过程中有着弥足轻重的地位[17]。Caspase是执行凋亡的主要酶类，Bcl-2蛋白家族主要通过调节内质网和线粒体中Ca2+浓度等机制调控细胞凋亡[18-19]。本研究对凋亡因子Bcl-2，Caspase-3[20]表达情况进行了检测，结果提示雷利度胺能够下调Bcl-2蛋白表达、并上调凋亡效应分子Caspase-3蛋白表达，促进MFC细胞凋亡，提示它们可能参与雷利度胺诱导的胃癌细胞凋亡的基因调控。

综上所述，雷利度胺对MFC细胞的体外生长增殖有明显抑制作用，并诱导该细胞凋亡，可能成为有希望的抗胃癌新药，这为抗胃癌的治疗提供了一个新的思路。

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（收稿日期：2016-09-04 本文编辑：李亚聪）