姜黄素类似物L6H4对2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用*

刘 曦， 马 骏， 胡茂通， 董细丹， 项兰婷， 顾倩如， 杜转运， 陈三妹， 陈国荣△

(1． 浙江中医药大学附属温州市中医院肾内科， 温州 325000； 2. 温州医科大学附属第一医院病理科， 浙江 温州 325015；3. 温州医科大学检验医学与生命科学学院， 浙江 温州 325035； 4. 绍兴文理学院医学院， 浙江 绍兴 312000)

姜黄素类似物L6H4对2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用*

刘 曦1， 马 骏2， 胡茂通2， 董细丹2， 项兰婷2， 顾倩如2， 杜转运3， 陈三妹4△， 陈国荣2△

(1． 浙江中医药大学附属温州市中医院肾内科， 温州 325000； 2. 温州医科大学附属第一医院病理科， 浙江 温州 325015；3. 温州医科大学检验医学与生命科学学院， 浙江 温州 325035； 4. 绍兴文理学院医学院， 浙江 绍兴 312000)

目的：探讨姜黄素类似物L6H4对2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用及机制。方法：24只SPF级雄性SD大鼠，随机分成3组(n=8)：对照组(NC组)、糖尿病组(DM组)和糖尿病治疗组(DT组)，采用高脂饮食加腹腔注射低剂量链脲佐菌素诱导2型糖尿病大鼠模型。DT组按0.2 mg/kg·d剂量的L6H4灌胃8周。治疗结束后测24 h尿蛋白、空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、尿酸(UA)。采用光镜和透射电镜观察大鼠肾脏的形态学改变；用免疫组化法测定大鼠肾脏组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、纤维粘连蛋白(FN)、四型胶原(Col-IV)的表达水平。结果：DM组大鼠24 h尿蛋白、FBG 、TG、Scr、BUN均明显升高(P<0.01)，肾小球体积增大、不规则，弥漫性系膜基质增多，伴基底膜不同程度的增生肥厚及足突融合现象；肾组织的TGF-β1、FN、Col-IV表达水平明显增加(P<0.05)。经L6H4治疗后，DT组的24 h尿蛋白、FBG、TG、Scr、BUN水平明显下降(P<0.01)，大鼠肾小球形态较规则，系膜区基质明显减少，足细胞肿胀、融合现象减轻；肾组织的TGF-β1、FN、Col-IV表达明显减少(P<0.05)。结论：L6H4可能通过下调TGF-β1的表达，抑制FN、Col-IV的大量分泌，减轻细胞外基质的沉积，从而起到保护2型糖尿病大鼠肾脏的作用。

姜黄素类似物L6H4；2型糖尿病；肾脏；转化生长因子-β1；大鼠

【DOI】 10.12047/j.cjap.5499.2017.003

据国际糖尿病联盟(IDF)统计，从全球范围来看，糖尿病患者在2011年已有3.7亿，2030年将达到5.5亿。其中糖尿病肾病(diabeticnephropathy，DN)的患病率和致死率已经成为仅次于糖尿病性心脑血管病变的慢性并发症之一。

有报告指出[1-3]，糖尿病肾病发生发展的机制与全身代谢紊乱引起的肾血流动力学不稳定以及各种细胞成分功能异常化呈一定相关性，但具体尚未明确；由于DN时机体存在严重的糖脂代谢紊乱，因此一旦发生DN，病情便会迅速进展，短期内发展成终末期肾病，提前进入肾替代治疗阶段，因此，如何有效延缓DN进展，改善患者的生活质量已经成为研究热点之一。

姜黄素是从传统中药姜黄提取的一种酚类色素，是其最主要的药理活性成分，具有抗氧化、降血脂、抗动脉硬化、抗衰老及抑制肿瘤细胞生长等作用。姜黄素类似物L6H4是一种在姜黄素基础上合成的新型不对称单羰基姜黄素衍生物，它不仅具有姜黄素的一般特性，而且具有更高的生物利用度、安全性，从而更好地发挥姜黄素的药理作用。本实验通过链脲佐菌素(streptozocin, STZ)诱导2型糖尿病大鼠模型，用L6H4进行干预，观察大鼠肾脏形态改变以及相关肾功能指标、细胞成分的表达结果，探讨姜黄素类似物L6H4对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型建立

健康SPF级雄性SD大鼠24只，体重180～220 g，普通饲料适应性饲养1周，按体重随机分为3组：正常对照组(normal control，NC组)、糖尿病组(diabetes mellitus，DM组)、糖尿病L6H4治疗组(DM+L6H4-treatment，DT组)；正常对照组继续普通饲料喂养；其余组改用高脂饲料，喂养4周后按35 mg/kg单次腹腔注射STZ造模，72 h后尾静脉测血糖，血糖>16.7 mmol/L则造模成功[4]。DT组按0.2 mg/kg·d剂量的L6H4(溶于1%羧甲基纤维素钠)灌胃8周,NC组、DM组予等容积的1%羧甲基纤维素钠灌胃。喂养及造模期间，实验大鼠自由进水，未使用胰岛素以及相关降糖药物。实验结束，禁食12 h，股动脉放血处死大鼠。取双侧肾脏，计算肾脏肥大指数(双侧肾脏质量之和/体质量)。

1.2 药品与试剂

姜黄素类似物L6H4(纯度99.5%，温州医科大学梁广教授赠)；1%羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司)；链脲佐菌素(上海润朗生物科技有限公司)。

FN、Col-IV、TGFβ1抗体(兔抗鼠)(北京中杉金桥生物试剂有限公司)；山羊抗兔单克隆抗体(二抗，PV6001 北京中杉金桥生物试剂有限公司)。

1.3 一般情况记录

观察大鼠的日常活动、饮食、大小便情况等，并记录大鼠体重变化。

1.4 生化指标检测

实验结束后，股动脉放血处死大鼠，留取血清，静置45 min后，3 000 r/min离心10 min，取上清液, 置于-20℃冰箱保存。采用日立7600全自动生化分析仪检测空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、甘油三酯(triglyceride, TG)、血肌酐(serum creatinine，Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、尿酸(uric acid，UA)、24 h尿蛋白(24-hour urinary protein)。

1.5 光镜标本制备

1.5.1 HE染色 大鼠处死取肾皮质厚约3 mm的组织，放入10%中性福尔马林固定液中固定，经乙醇梯度脱水、石蜡包埋后，制成厚约3 μm的切片，行HE染色，中性树胶封固。光镜下观察肾小球体积、系膜基质、毛细血管基底膜等的变化情况。

1.5.2 Masson染色 染色标本制作石蜡切片，常规脱蜡，苏木素染色5 min，1%盐酸乙醇分化1～3 s，冲洗15 min，置于红色Masson液(变色酸2R 0.5 g+磷钨酸1.0 g+冰醋酸1.0 ml+蒸馏水100 ml)3 min，流动水冲洗5 s，置于0.1%亮绿色Masson液15 s(亮绿色物质0.1 g+20%乙醇100 ml)，乙醇梯度脱水各10 s：80%乙醇→95%乙醇(Ⅰ)→95%乙醇(Ⅱ)→无水乙醇(Ⅰ)→无水乙醇(Ⅱ)，石炭酸15 s，二甲苯3 s，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察肾脏胶原纤维的变化情况。

1.6 电镜标本制备

取肾皮质(大小约为：0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm)小块组织，放入2.5%戊二醛中固定，然后放入4℃冰箱固定2 h，PBS漂洗，锇酸后固定，PBS漂洗，丙酮梯度脱水，Epon8l2 包埋，半薄切片定位，PT-XL型超薄切片机切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，透射电子显微镜下观察超微结构[5，6]。

1.7 免疫组织化学染色 (Envision二步法)

常规石蜡切片经烘烤、二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、3%过氧化氢液中阻断、高温高压抗原修复后，滴加一抗TGF-β1、FN、Col-IV，37℃烤箱中孵育1 h，室温下复温5 min，滴加二抗，37℃烘箱中孵育15 min，DAB显色2 min，苏木素复染，中性树胶封固，PBS代替一抗作阴性对照。结果判定：胞浆呈棕黄色为阳性表达。应用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件计算平均光密度(IOD/Area)评估TGF-β1、FN、Col-IV的表达情况。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况

NC组大鼠精神状态正常，饮食规律，DM组大鼠出现不同程度的多饮、多尿、多食，2周后体重逐渐下降、消瘦。与NC比较，病变组大鼠体重明显下降，肾脏肥大指数明显增加(P<0.01，表1)；经L6H4干预后，DT组大鼠消瘦状况明显改善(P<0.05)，肾脏肥大指数明显下降(P<0.01)。

GroupBodyweight(g)Hypertrophyindex(10-3)NC425.75±14.373.20±0.16DM312.00±20.59**4.09±0.29**DT349.38±23.07##3.81±0.16#

NC： Normal control； DM： Diabetes mellitus； DT： DM+L6H4-treatment

**P<0.01vsNC；##P<0.05,##P<0.01vsDM

2.2 24 h尿蛋白、血糖、血脂的改变

与NC组比，DM组24 h尿蛋白、FBG、TG均明显升高(P<0.01，表2)，经姜黄素类似物L6H4治疗后，上述指标均有明显下降(P<0.01)。

Group24hUrinaryprotein(mg/d)FBG(mmol/L)TG(mmol/L)NC9.61±2.376.73±0.5090.295±0.128DM94.13±9.23**30.47±1.82**3.045±0.431**DT66.86±8.69##13.73±1.15##0.331±0.112##

NC： Normal control； DM： Diabetes mellitus； DT： DM+L6H4-treatment； FBG： Fasting blood glucose; TG: Triglyceride

**P<0.01vsNC；###P<0.01vsDM

2.3 肾功能指标的改变

与NC组比，DM组大鼠的血肌酐、尿素氮水平均有明显升高(P<0.01，表3),经L6H4干预后，DT组的血肌酐、尿素氮水平明显下降(P<0.01)，尿酸水平未见明显差异。

2.4 肾脏形态学改变

2.4.1 HE染色观察 NC组大鼠肾脏的肾小球体积正常，形态规则，毛细血管袢排列整齐，管壁规则。与NC相比，DM组大鼠的肾小球体积明显增大，毛细血管袢卷曲，系膜基质增生。经L6H4治疗后，DT组大鼠的肾小球体积接近正常，形态规则，系膜区基质增生明显减少(图1，见彩图页Ⅰ)。

GroupScr(umol/L)BUN(mmol/L)UA(umol/L)NC33.29±9.277.75±1.11107.13±22.91DM97.14±9.67**15.91±2.64**120.50±20.16DT62.69±8.81##9.85±1.88##113.75±14.61##

NC： Normal control； DM： Diabetes mellitus； DT： DM+L6H4-treatment; Scr: Serum creatinine; BUN: Blood urea nitrogen; UA: Uric acid

**P<0.01vsNC；###P<0.01vsDM

2.4.2 Masson染色观察 NC组大鼠的肾小球毛细血管基底膜、系膜区有少量胶原纤维沉积，呈蓝绿色。DM组大鼠肾小球表现为系膜区细胞增殖，系膜基质增生，系膜区及肾小球中央区可见大量呈蓝绿色的基质，经L6H4干预后，可见蓝绿色的阳性基质减少(图2，见彩图页Ⅰ)。

2.4.3 电镜观察 电镜下观察，肾小球滤过膜的内层由毛细血管内皮细胞构成，其上有窗孔结构，滤过膜的中间层由基底膜构成，呈负电子状态，滤过膜的外层由足细胞构成，其表面有足突，相互交错，相邻足突之间有一定的裂隙。与NC组相比，DM组大鼠的内皮细胞肿胀、变形，基底膜明显增厚，足突变短、融合。L6H4干预后，DT组大鼠的基底膜厚度均匀接近正常，足突融合现象消失(图3)。

Fig. 3 Ultrastructure of rats kidney podocyte in each group observed under transmission electron microscope A： Normal control； B： Diabetes mellitus； C： DM+L6H4-treatment

2.5 免疫组化检测

2.5.1 TGF-β1表达的改变 NC组大鼠的肾小球毛细血管基底膜区、系膜区以及肾小管上皮细胞可见微量呈片状分布的棕褐色阳性基质，DM组大鼠的上述区域可见大量棕褐色致密颗粒(P<0.01)，呈强阳性表达，经L6H4干预后，DT组大鼠的TGF-β1的表达水平明显减轻(P<0.01，表4，图4，图4见彩图页Ⅰ)。

2.5.2 FN表达的改变 NC组大鼠在肾小球基底膜区可见少量棕黄色的阳性颗粒表达，DM组FN阳性表达量明显增多(P<0.01)，经L6H4治疗后，DT组的FN表达量明显减少(P<0.05，表4，图5，图5见彩图页Ⅱ)。

2.5.3 Col-Ⅳ表达的改变 NC组大鼠在肾小球基底膜、系膜区可见少量呈条索状的褐色致密基质，与NC组相比，DM组可见基底膜、系膜区的染色显著加深，可见大量褐色基质沉着(P<0.01)，经L6H4干预后，DT组的阳性表达水平有明显下降(P<0.01，表4，图6，图6见彩图页Ⅱ)。

GroupTGF-β1FNCol-IVNC0.284±0.0130.281±0.0130.267±0.007DM0.320±0.017**0.400±0.035**0.352±0.019**DT0.304±0.008##0.327±0.017#0.292±0.013##

NC： Normal control； DM： Diabetes mellitus； DT： DM+L6H4-treatment; TGF-β1: Transforming growth factor-beta 1; FN: Fibronectin; Col-IV: Collogen IV

**P<0.01vsNC；##P<0.05,##P<0.01vsDM

3 讨论

糖尿病肾病(DN)作为糖尿病全身微血管病性合并症之一，已成为导致终末期肾病的第二位原因。有研究指出[7]，长期高血糖、高血脂状态在促进DN发生发展的过程中具有重要作用。体内过多的糖类可与血液循环中游离氨基酸或组织蛋白结合，最终引起晚期糖基化终末产物(AGEs)不可逆增长，而AGEs可直接引起肾脏损伤；另外，慢性高糖状态还可以通过活化蛋白激酶C、下调肝素酶的表达导致肾小球基底膜对蛋白的通透性增加[8]，加速肾功能恶化。因此，如何有效的控制血糖、血脂，改善异常代谢有着重要意义。

本实验中，采用高脂饮食联合腹腔注射STZ建造2型糖尿病大鼠模型，DM组大鼠空腹血糖、甘油三酯与正常组比较明显升高(P<0.01)；肾脏肥大指数、血肌酐、血尿素氮、24 h尿蛋白定量与正常组比较明显增加(P<0.01)，肾脏形态学可见肾小球体积明显增大，系膜基质增生，基底膜足细胞足突融合，表明肾脏受到明显损伤，成功诱导了DN，经L6H4干预后，DT组大鼠FBG、TG、Scr、BUN、24 h尿蛋白定量显著降低(P<0.01)，表明L6H4能通过调节糖脂的代谢异常有效保护肾功能，进而延缓DN的进展。

国内外大量研究表明[9],糖尿病肾病发展过程中主要病理生理学改变是多种细胞因子介导的各种胶原蛋白、结构蛋白合成与降解失衡，细胞外基质大量沉积于肾小球、肾间质内，破坏肾小球基本结构，最终进展为终末期肾病。在此过程中，由TGF-β1介导的信号通路激活是主要的机制之一[10-15]，这些通路可以通过诱导足细胞脱离基底膜，增加蛋白排泄率，加速肾小球滤过膜的损伤；刺激以IV型胶原蛋白、纤维粘连蛋白为主的细胞外基质大量沉积，导致肾小球基底膜肥厚，肾小管上皮细胞变性重塑，最终导致肾功能受损[16-18]。

本实验中，DM组肾脏肥大指数、TGF-β1、FN、Col-IV型胶原含量的表达与正常组比较显著增加(P<0.01)，肾脏形态学观察可见系膜区有胶原纤维及基质沉积，内皮细胞肿胀，基底膜增厚，足突融合现象，经L6H4干预后，DT组肾脏肥大指数、FN的表达量明显降低，TGF-β1、COL-Ⅳ型胶原表达量显著减少，形态学可见系膜区基质沉积显著减少，足突融合现象减轻，表明L6H4可能通过下调TGF-β1表达，减少细胞外基质的增殖与沉积，从而达到保护和治疗肾脏的作用。

目前临床上对于糖尿病肾病的治疗尚未形成统一的认识，有报道指出[19]，ACEI或ARB与降糖、调脂、改善微循环相关的药物合用具有一定的临床疗效，但因药物的临床使用禁忌、配伍禁忌及患者的个体情况，故临床应用尚无法全面普及；有研究显示[20]，豆科多年生草本植物中药黄芪的提取物中因含有黄芪皂苷、元素硒、多糖等成分，能保护肾小球基底膜的电荷屏障，减轻肾小球的高滤过，降低DN患者早期的高凝、高血糖状态，但因其提取工艺复杂，成本高，目前尚无法在临床广泛应用；姜黄素类似物L6H4是新型不对称单羰基姜黄素衍生物，不仅具有姜黄素的药理活性，而且化学结构更稳定，炎症抑制活性更强，制作过程相对简单，前期大量实验证明[21-23]其对糖尿病引起的心、肝、脑等主要脏器的病变具有明显的疗效，是一个值得推广和临床应用的新型药物。

综上所述， L6H4具有改善糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱和保护肾功能的作用，其机制可能与其降血糖、调脂以及通过下调肾脏TGF-β1的表达水平，从而减少FN、Col-IV型胶原分泌有关。

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Protective effects of Curcumin analogue L6H4 on kidney from type 2 diabetic rats

LIU Xi1， MA Jun2， HU Mao-tong2， DONG Xi-dan2， XIANG Lan-ting2， GU Qian-ru2,DU Zhuan-yun3, CHEN San-mei4△, CHEN Guo-rong2△

(1. Department of Nephrology， the Affiliated Wenzhou Chinese Medical Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Wenzhou 325000;2. Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325015; 3. Department of Biology, School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035; 4. Medical College, Shaoxing University， Shaoxing 312000, China)

Objective: To investigate the protective effect of curcumin analogue L6H4 on the kidney from the type 2 diabetic rats. Methods: Twenty-four SPF male SD rats were randomly divided into 3 groups(n=8): normal control group(NC),diabetes mellitus group(DM) and DM+L6H4-treatment group(DT). After rats were fed with high-fat diet for 4 weeks, both the DM and DT groups were injected with streptozotocin intraperitoneally to induce type 2 diabetes mellitus models. The rats in DT group were given L6H4 by gavage at the dose of 0.2 mg/kg·d for 8 weeks. After the treatment, the 24 h urinary protein, fasting blood glucose (FBG), triglyceride (TG), serum creatinine(Scr)，blood urea nitrogen (BUN) and uric acid (UA) were detected biochemically. The pathological changes of the kidneys were observed under light and transmission electron microscopes. The expressions of TGF-β1, FN and Col IV were detected by immunohistochemistry. Results: The levels of the 24 h urinary protein, FBG, TG, Scr and BUN were elevated significantly in diabetic group(P<0.01). The glomerular volume of DM group rats became irregularly enlarged, diffused mesangial matrix accumulated, with basal membrane proliferous hypertrophy and fusion phenomenon of foot process , the expressions of TGF-β1,FN and Col-IV were elevated significantly (P<0.05). After treated with L6H4, the levels of the 24 h urinary protein, FBG, TG, Scr and BUN were decreased in DT group compared to DM group (P<0.01), the morphological changes of kidney were ameliorated. The expression levels of TGF-β1, FN and Col-IV were downregulated (P<0.05). Conclusion: L6H4 exerts the protective effect on kidneys of type 2 diabetic rats by reducing expression of TGF-β1, inhibiting secretion of Col-IV and FN, relieving the deposition of the extracellular matrix.

curcumin analogue L6H4； type 2 diabetes; kidney； transforming growth factor-beta 1; rat.

浙江省公益性技术应用研究计划项目(2011C23123)

2016-10-08 【修回日期】2016-11-24

R365

A

1000-6834(2017)01-011-05

△【通讯作者】Tel: 0577-55579792，0575-88345685; E-mail: chengr1978@aliyun. com， csm498@163.com