槟榔碱对3T3-L1脂肪细胞脂代谢的影响*

凌宏艳， 贺 娟,2+， 杨丝丝， 张恺芳， 何剑琴， 朱责梅， 奉水东

(1. 南华大学生理学教研室， 2. 湖南医药学院生理学教研室， 3. 南华大学社会医学与卫生事业管理学教研室， 湖南 衡阳 421001)

槟榔碱对3T3-L1脂肪细胞脂代谢的影响*

凌宏艳1， 贺 娟1,2+， 杨丝丝1， 张恺芳1， 何剑琴1， 朱责梅1， 奉水东3Δ

(1. 南华大学生理学教研室， 2. 湖南医药学院生理学教研室， 3. 南华大学社会医学与卫生事业管理学教研室， 湖南 衡阳 421001)

目的：观察槟榔碱对3T3-L1脂肪细胞脂代谢的影响并探讨其可能机制。方法：采用经典的“鸡尾酒”法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化成熟，随后用不同浓度的槟榔碱(0、25、50、100 μmol/L)处理成熟脂肪细胞72 h。72 h后，四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞的活性；油红 O 染色观察胞浆内脂滴情况；Western blot检测脂肪酸合成酶(FAS)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)蛋白表达。结果：诱导分化成熟的脂肪细胞胞浆内可见大量脂滴；MTT显示：0～100 μmol/L槟榔碱对脂肪细胞活力无显著影响；油红O染色后脂质含量测定结果表明槟榔碱能减少成熟脂肪细胞中脂质含量；Western blot结果显示：与0 μmol/L组(对照组)相比，槟榔碱可显著降低脂肪细胞内FAS的蛋白表达，增加ATGL和HSL的蛋白表达；其中以50 μmol/L组最为显著。结论：槟榔碱使脂肪细胞脂解增强，可能与降低脂质合成关键酶FAS的表达，增加脂质分解代谢关键酶ATGL和HSL的表达有关。

槟榔碱；3T3-L1脂肪细胞；脂代谢

【DOI】 10.12047/j.cjap.5355.2017.005

脂肪细胞是体内重要的能量储存库，目前认为脂肪细胞的代谢异常与多种疾病相关，如肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病等[1]。因此，脂肪细胞正成为治疗肥胖等代谢性疾病的药物靶点。槟榔碱是从天然植物槟榔中提取的生物碱，具有杀菌、促消化、抗动脉粥样硬化等作用[2-4]。流行病学研究表明咀嚼槟榔与口腔癌及2型糖尿病和代谢综合症的发生有

关[3-7]，本课题组前期实验研究结果表明：槟榔碱可改善2型糖尿病SD大鼠的糖、脂代谢紊乱和胰岛素抵抗，降低高糖环境对胰岛β细胞的损伤，促进3T3-L1前脂肪细胞的增殖，抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化[8-10]。提示槟榔碱与2 型糖尿病发生发展密切相关，但槟榔碱是否参与脂肪细胞脂质代谢，目前尚不清楚。因此，本研究以成熟的3T3-L1脂肪细胞为研究对象，观察槟榔碱对3T3-L1脂肪细胞脂质代谢的影响并探讨其作用机制，从而在细胞水平上为槟榔碱改善糖尿病以及肥胖患者的作用机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

3T3-L1 前脂肪细胞株购于美国ATCC 公司，DMEM培养基、胰蛋白酶和胎牛血清均购于美国Gibco公司，槟榔碱、地塞米松(dexamethasone, Dex) 、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(1-methyl-3-isobuthylxanthine, IBMX) 、胰岛素、MTT和 油红 O染料均购于Sigma公司，蛋白检测试剂盒购于上海碧云天生物公司；抗FAS、ATGL和HSL抗体购于细胞信号公司。

1.2 3T3-L1前脂肪细胞培养和诱导分化

用含10%新生小牛血清的L-DMEM，在37℃，5% CO2条件下培养3T3-L1细胞，待细胞生长至完全融合后2 d(第0天) 时开始诱导分化，将培养液换成含10%胎牛血清、0.5 mmol/L IBMX 、10 μg/ml 胰岛素、1.0 μmol/L Dex的L-DMEM刺激，2 d后撤去IBMX和地塞米松等诱导剂，换用只含10 μg/ml胰岛素、10%胎牛血清的L-DMEM培养2 d，之后每2天换用含10%胎牛血清的L-DMEM，至第9天90%3T3-L1细胞呈脂肪细胞表型，倒置显微镜拍照。

1.3 MTT检测槟榔碱对脂肪细胞活性的影响

将 3T3-L1 前脂肪细胞按每孔5×103个细胞接种于96 孔板中，每孔体积150 μl，按1.2方法将细胞诱导分化成熟，随后加入不同浓度的槟榔碱(0、25、50、100 μmol/L)处理72 h，每孔加入0.5%的MTT溶液20 μl，继续培养4 h后终止培养，将培养液倒尽吸干，每孔加入150 μl DMSO，37℃振荡15 min，使结晶溶解后用于比色。在酶标仪上选择570 nm波长，测定各孔的光密度值。

1.4 油红O染色及脂质含量测定

采用不同浓度的槟榔碱(0、25、50、100 μmol/L)处理分化成熟的脂肪细胞72 h，随后进行油红O染色，拍照，异丙醇裂解细胞后通过酶标仪对脂滴着色程度进行比色，570 nm 波长检测OD值，定量分析细胞内脂质的含量。

1.5 Western blot检测脂肪细胞FAS, ATGL和HSL蛋白的表达

不同浓度的槟榔碱处理分化成熟的脂肪细胞72 h后，弃去陈旧培养基，用预冷的PBS洗涤细胞2～3次，倒尽残留PBS，加入预冷的细胞裂解液70～100 μl，置冰上裂解5～10 min，待细胞样品完全破碎后，用细胞刮刮下细胞，将细胞裂解液移至准备好的 1.5 ml的EP管中，冰上超声20～30 s以剪切基因组DNA，4℃，12,000/min离心10 min,取上清，采用BCA比色法进行蛋白定量，取蛋白样品30 μg进行电泳、转膜、封闭，加入抗脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)、甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)、激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase，HSL)抗体孵育，洗涤后加入辣根过氧化酶标记的二抗，孵育，充分洗涤后与ECL化学发光试剂反应，曝光后扫描，用图像分析软件进行光密度分析。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞

诱导分化前3T3-L1前脂肪细胞形态与成纤维细胞相似，呈梭形，胞浆中无脂滴；至诱导分化第9天时，95%的3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞，表现为细胞浆丰富，大量的体积较大的脂滴分布于细胞核周围，形成“戒环样”结构，即为典型的成熟脂肪细胞形态(图1)。

Fig. 1 Morphology of 3T3-L1 preadipocyte (A)and adipocyte (B)

2.2 槟榔碱对3T3-L1脂肪细胞活性的影响

为明确槟榔碱是否影响成熟脂肪细胞的活性，我们用不同浓度的槟榔碱(0、25、50、100 μmol/L)处理细胞72 h，并用MTT法测定细胞存活率。结果显示：不同浓度的槟榔碱对细胞活性无显著影响(表1)。

GroupRelativesurvivalrate(%)Control100±3.725μmol/L90±4.250μmol/L93±3.5100μmol/L88±4.8

2.3 槟榔碱对3T3-L1脂肪细胞脂质含量的影响

油红O染色后异丙醇裂解细胞进行OD值测定，结果显示：对照组相比，不同浓度的槟榔碱组细胞内脂质含量显著降低，其中50 μmol/L组降低最明显，提示槟榔碱可抑制细胞内脂质的积聚(图2，表2)。

Fig. 2 Effects of arecoline on lipid content in 3T3-L1 adipocytes (oil red O staining, ×10) 1: Control group (0 μmol/L arecoline group); 2: 25 μmol/L arecoline group; 3: 50 μmol/L arecoline group; 4: 100 μmol/L arecoline group

GroupLipidContentControl100±4.325μmol/L43±3.8**50μmol/L11±2.6**100μmol/L21±2.9**

**P<0.01vscontrol group

2.4 槟榔碱对3T3-L1脂肪细胞FAS, ATGL和HSL蛋白表达的影响

与对照组相比，25、50和100 μmol/L槟榔碱处理组可使FAS蛋白表达分别降低15.7%、46.2%和27.6%；使ATGL蛋白表达分别增加31.5%、99.2%和41.6%；使HSL总蛋白表达分别增加43.7%、81.8%和31.5%(图3)。

3 讨论

脂肪组织的脂质代谢包括脂肪酸的合成和甘油三酯的水解。脂肪酸合成酶(FAS)是脂肪细胞脂肪酸合成的关键酶，能催化细胞以乙酰辅酶A 和丙二酰辅酶A为底物合成长链脂肪酸，内源性脂肪酸以甘油三酯的形式储存于细胞。FAS主要与细胞内源性脂肪合成相关，参与脂肪细胞的分化，在脂肪细胞从纤维母细胞分化为成熟脂肪细胞过程的后期高表达，与脂肪细胞中脂滴的形成密切相关。而甘油三酯脂肪酶(ATGL)和激素敏感脂肪酶(HSL)是水解甘油三酯和甘油二酯的主要水解酶，占白色脂肪组织中脂解酶活性的95%[12]。

本实验中，油红O染色和脂质含量测定结果显示：槟榔碱可降低成熟脂肪细胞中脂质的含量。在脂肪细胞脂质合成代谢过程中，内源性脂肪酸的合成过程包括如下几个步骤：(1)乙酰-CoA 在乙酰-CoA 羧化酶的催化下缩合成丙二酸单酰-CoA；(2)乙酰-CoA 与缩合成的丙二酸单酰-CoA 在FAS的催化下经过缩合、还原、脱水、再还原的循环反应过程，每循环一次增加两个碳原子，最终合成长链脂肪酸。在上述合成过程中FAS是合成长链脂肪酸的关键酶，当FAS酶活性高时，机体合成大量的脂肪酸，脂肪酸与甘油酯化，形成脂肪，过量的脂肪在体内蓄积，从而导致肥胖。因此，降低FAS酶活性可以减少脂肪合成。此外，当在小鼠中枢神经注射FAS的抑制剂C75后，小鼠食欲降低，脂肪酸氧化增加，小鼠体内脂肪组织含量减少[13，14]。由此可知，抑制FAS的表达可减少机体脂肪形成。本实验结果发现槟榔碱可显著降低分化成熟的3T3-L1脂肪细胞中FAS的蛋白表达，表明槟榔碱通过降低FAS的表达从而抑制脂肪细胞中脂质的合成，降低脂肪细胞中脂质的蓄积。

另一方面，脂肪细胞中脂质的含量与脂质分解代谢有关，ATGL和HSL是脂肪组织中甘油三酯水解为甘油和游离脂肪酸的主要脂解酶。ATGL在白色脂肪组织中大量表达，主要水解白色脂肪组织中甘油三酯为甘油二酯和游离脂肪酸。研究发现，当小鼠小肠内缺乏ATGL时，小肠中甘油三酯水解酶活性降低，细胞内甘油三酯含量增加[15]。因此，ATGL在维持机体脂质内环境稳态中起着重要作用。另一个脂肪水解的限速酶是HSL，主要在脂肪组织中表达，其次在肾上腺、睾丸、肌肉中少量表达。研究显示在HSL基因敲除小鼠中，脂肪细胞对儿茶酚胺诱导的甘油释放和脂肪酸减少敏感性明显降低[16]。因此，ATGL和HSL在脂肪细胞脂质水解中起着十分重要的作用。本研究结果显示：槟榔碱可显著增加分化成熟的3T3-L1脂肪细胞中ATGL和HSL的蛋白表达水平，表明槟榔碱可促进脂肪细胞中甘油三酯的水解，从而减少甘油三酯的含量。

总之，本研究结果显示：不同浓度的槟榔碱可减少分化成熟的3T3-L1脂肪细胞中脂质的含量，其中50 μmol/L槟榔碱组效果最好。可能原因是低浓度的槟榔碱通过降低FAS蛋白表达、增加ATGL和HSL蛋白表达从而抑制脂肪细胞中脂质的合成，降低脂肪细胞中脂质的蓄积；高浓度的槟榔碱也许对细胞产生毒性作用，从而改变基因表达，但其具体的作用机制，需进一步研究。由此可见，50 μmol/L槟榔碱可减少成熟脂肪细胞中甘油三酯的合成，减少脂质的蓄积，同时增加细胞内甘油三酯的水解，进一步降低脂肪细胞中脂质的蓄积，从而抑制脂肪细胞的肥大。但是，正常脂肪细胞中脂质的合成和分解维持在一个动态平衡，任何一方面失调均可引起相关的疾病。槟榔碱可使机体脂肪细胞脂肪酸合成减少，分解增加，使机体游离脂肪酸增加，这将有可能引起脂肪的异位沉积，从而降低代谢相关器官的胰岛素敏感性。由于代谢综合征是一个复杂的疾病，它的形成包括环境与遗传因素的相互作用，联系槟榔碱与代谢综合征之间的机制并不能通过某一个实验模型来完全阐释清楚。本结果仅仅只能说明槟榔碱对脂肪细胞在脂肪形成和分解中的一部分作用。槟榔碱在肥胖和代谢综合征中的作用还需进一步研究。

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The effects of arecoline on the lipid metabolism of 3T3-L1 adipocytes

LING Hong-yan1, HE Juan1,2+, YANG Si-si1, ZHANG Kai-fang1, HE Jian-qin1, ZHU Ze-mei1， FENG Shui-dong3Δ

(1. Department of Physiology, University of South China, 2. Department of Physiology, Hunan Institute of Medicine, 3. Department of Social Medicine and Health Service Management, University of South China， Hengyang 421001, China)

Objective: To observe the effects of arecoline on lipid metabolism in 3T3-L1 adipocytes and explore its possible mechanisms. Methods: 3T3-L1 pre-adipocytes were induced into adipocytes with the classic“cocktail” method, subsequently, adipocytes were treated with arecoline at the concentrations of 0, 25, 50 and 100 μmol/L for 72 hours. After 72 hours, cell vability was measured with MTT method, lipid droplet accumulation in the cytoplasm was observed with oil red O staining, the protein expression of fatty acid synthase (FAS), adipose triglyceride lipase (ATGL) and hormone-sensitive lipase (HSL) were detected by Western blot assay. Results: There were a large number of lipid droplets in the cytoplasm in the differentiated 3T3-L1 adipocytes. MTT results showed that 0～100 μmol/L arecoline had no significant effect on cell vability; oil red O staining found arecoline reduced lipid amount in 3T3-L1 adipocytes; Western blot results showed that compared with 0 μmol/L arecoline group (the control group), arecoline significantly reduced the protein level of FAS and increased the protein levels of ATGL and HSL, and 50 μmol/L arecoline group was the most significant. Conclusion: Arecoline significantly increased lipolysis of 3T3-L1 adipocyte, which might be associated with decreased the FAS expression of key enzyme of lipid synthesis and increased the ATGL and HSL expression of key enzyme of adipolysis.

arecoline; 3T3-L1 adipocyte; lipid metabolism

教育部留学归国基金(教外司留[2014]1685号)；湖南省科技厅(2015JC3085)；南华大学留学归国基金(2013XQD49)；南华大学研究生科研创新项目(2015XCX36)

2015-09-22 【修回日期】2016-06-12

R332；R977.15

A

1000-6834(2017)01-022-04

△【通讯作者】Tel: 86-0734-8281621; E-mail: shuidong f@hotmail.com；#+： 并列第一作者