蝎源活性肽对早期帕金森病大鼠脑源性营养因子及神经肽Y的影响*

于德钦， 陈 薇， 殷盛明△， 安 冬， 赵 丹， 孟 旭， 徐 红， 王冬梅， 孙艺平,， 赵 杰, 张万琴

(1. 大连医科大学生理学教研室， 2. 大连医科大学机能实验室， 辽宁 大连 116044)

蝎源活性肽对早期帕金森病大鼠脑源性营养因子及神经肽Y的影响*

于德钦1， 陈 薇1， 殷盛明1△， 安 冬1， 赵 丹1， 孟 旭1， 徐 红2， 王冬梅， 孙艺平1,2， 赵 杰1, 张万琴1

(1. 大连医科大学生理学教研室， 2. 大连医科大学机能实验室， 辽宁 大连 116044)

目的：研究蝎源活性肽对早期帕金森病(PD)大鼠脑源性营养因子(BDNF)及神经肽Y(NPY)的影响。方法：实验动物随机分为三组(n= 11)，分为早期PD模型组、假手术对照组和蝎源活性肽治疗组。将6羟多巴(6-OHDA, 20 μg/3 μl含0.1%抗坏血酸生理盐水)注射到SD大鼠右侧纹状体制备早期PD模型，注射2周后，通过旋转行为学检测造模是否成功；造模成功的早期PD大鼠，和相应的对照组腹腔注射蝎源活性肽(2.20 mg/kg·d)处理1周。3周后，用免疫组织化学法检测大鼠脑源性营养因子及神经肽Y的免疫反应活性。结果：在6-OHDA给药侧，PD动物与假手术对照组相比较，BDNF免疫反应活性明显增强，NPY免疫反应活性明显减少，蝎源活性肽处理可以逆转这些异常改变。结论：改变PD早期中脑内NPY与BDNF的免疫反应活性是蝎源活性肽对早期PD大鼠中脑多巴胺能神经元的保护作用机制之一。

帕金森病；脑源性神经营养因子；神经肽Y；蝎源活性肽；大鼠

Patkinson’s disease； brain-drived neurotrophic factor； neuropeptide Y； rat

【DOI】 10.12407/j.cjap.5387.2017.007

帕金森病(Parkinson＇s disease, PD)是慢性神经系统变性疾病，常见于中老年人。神经系统变性疾病是是指由于神经元变性所导致的神经系统退行性疾病，其影响运动功能和广泛的认知领域包括执行功能[1]，目前尚无有效的治疗手段。PD的发病主要是因为黑质多巴胺能神经元出现进行性变性，进而导致纹状体内多巴胺水平显著降低[2]。PD起病缓慢，有报道PD的早期发病可能长达10年之久[3]。早期PD的发病原因尚不清楚,与年龄和环境等其它因素有关，其发病机制与自由基、炎症、神经营养因子缺乏和凋亡等相关，这些因素相互作用最终引起神经元死亡[4]。蝎源活性肽具有抗氧化活性并减轻PD动物线粒体损伤，保护多巴胺能神经元。

脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)在大脑内分布广泛，对多巴胺能神经元具有营养和保护作用。神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)即神经肽酪氨酸，由36个氨基酸构成，是一种活性多肽，属于胰多肽家族，在脑内和胃肠道含量丰富。NPY在中枢神经系统中有广泛的表达，在重要的生理功能和病理条件如癫痫、慢性疼痛、焦虑和神经退行性疾病中起着重要的作用[5]。现已知的NPY受体亚型为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5，共5种，都为G蛋白偶联受体。 研究显示，神经肽通过作用于Y1、Y2受体，可参与情绪的调节，如抑郁大鼠模型脑组织YI受体显著减少，Y2受体显著增加[6]。

神经毒素6-羟多巴胺(6 hydroxydopamine,6-OHDA)结构类似于多巴胺,注射6-OHDA于大鼠纹状体内，会使黑质发生退行性变，作用于多巴胺能神经元，常用于PD模型的制备[7,8]。本课题组前期工作已发现蝎源活性肽对MPTP处理小鼠及6-OHDA处理的大鼠PD模型动物的黑质多巴胺能神经元的损伤具有保护作用[9,10]。本实验制备早期6-OHDA大鼠PD模型，观察PD模型的中脑内BDNF及NPY的表达情况，进一步观察蝎源活性肽的神经保护作用。为早期PD的发病机制及诊治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 PD动物模型制备与分组

(1)实验分组及处理：蝎源活性肽(提取于东亚钳蝎，以提取物的蛋白测定量为注射剂量依据，本课题组专利，ZL01161169)；实验动物随机分为三组(n= 11)，分为早期PD模型组、假手术对照组和蝎源活性肽治疗组。将6羟多巴(6-OHDA, 20 μg/3 μl含0.1%抗坏血酸生理盐水)注射到大鼠右侧纹状体制备早期PD模型，注射2周后，通过旋转行为学检测造模是否成功；造模成功的早期PD大鼠腹腔注射蝎源活性肽(2.20 mg/kg·d)处理1周。3周后，用免疫组织化学法检测大鼠脑源性营养因子及神经肽Y的免疫反应活性。所用实验动物为雄性健康SD大鼠(大连医科大学动物实验中心，许可证号为SCXX Ⅱ2008002)，体重为170～230 g。

(2)麻醉(4%水合氯醛，ip)、固定(脑立体定位仪)、选取靶点(根据George Paxinos&Charles Watson大鼠脑定位图谱)。早期 PD组的注射靶点为纹状体，坐标定位为AP=+1.0(前囟前)， R=3.0 mm(向右旁开)，H =-4.5 mm(硬膜下)。早期PD模型组和蝎源活性肽治疗组的动物脑内注射溶解于Vehicle(0.1%抗坏血酸，0.9% NaCl)的6-OHDA，注射剂量为20 μg/3 μl。缓慢注射，留针3 min后，慢慢退出。在相同条件下假手术对照组动物，将同等容积的Vehicle注入靶点。蝎源活性肽单独对照组和治疗组在完成行为学测试后给予2.20 mg/kg·d的蝎源活性肽腹腔注射1周，其余两组则给予NS。

1.2 动物行为学检测

术后2周，于SD大鼠颈背部注射阿朴吗啡(0.5 mg/kg，ih)，溶于0.4 ml NS中，诱发其旋转运动(30 min)，记录旋转次数，每分钟7转以下的左旋鼠是成功的早期PD大鼠模型。检测过程中环境安静，切勿嘈杂喧闹。

迈步实验：(1)适应环境：大鼠适应实验环境3 d，将1.1 m长木板倾斜30°放置与鼠笼相连，训练大鼠爬回笼中。(2)开始实验：将大鼠双后肢固定并缓慢轻轻上提，使其离开木板，随后将一侧前肢固定，另一侧前肢不离开木板，观察待其前肢自动移动时，开始计时。(3)记录时间：记录大鼠从迈步开始到返回鼠笼所用总时间与大鼠走过整个桌面斜面的总步数。整个实验的测验顺序：左→右，并且重复2次。

1.3 免疫组织化学反应

实验第3周，进行脑组织灌流固定，之后蔗糖脱水，冰冻切片后，选取中脑黑质脑片，采用漂浮法法进行免疫组织化学染色。用PBS漂洗3次后用含1%过氧化氢的PBS处理以消除内源性过氧化物酶。山羊血清封闭2 h。分别加入BDNF(Sigma，1∶500)和NPY(Sigma，1∶500)抗体。4℃孵育过夜。用生物素化二抗进行室温孵育2 h，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液进行室温孵育1 h，充分漂洗后，用新鲜配制的显色剂(DAB)进行显色，适时终止反应。将脑片晾干后，再用二甲苯透明，使用中性树脂封片。对照组使用PBS代替一抗。实验中加以阴性对照组(不加入一抗)以确认BDNF和NPY免疫反应阳性的结果。

1.4 免疫染色阳性细胞的计数

定量分析BDNF-IR和NPY-IR的阳性细胞数，采用病理图文分析系统。各组选取大鼠6只。根据George Paxinos &Charles Watson的The RateBrain选取定位，首先在低倍物镜下观察，定位黑质致密部(SNR)，测量面积是20 000 μm2(100 μm×200 μm)，选取四个部位计数并取其平均值。计算框内BDNF-IR和NPY-IR阳性细胞的个数，而后随机选6个BDNF-IR和NPY-IR阳性细胞，将其胞浆的平均灰度测出。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 行为学结果

迈步实验中，与对照组相比，早期PD大鼠回到鼠笼时间与总步数无明显差异(表1)。

GroupTime(S)1std2ndd3rddStep1std2ndd3rddControl5.00±0.564.83±0.563.42±0.349.00±0.9010.00±0.759.00±0.67PD5.14±0.645.00±0.464.07±0.979.00±0.529.00±0.368.00±0.73

PD: Parkinson’s disease

2.2 BDNF和NPY免疫组化结果

免疫组化结果显示，与对照组相比，6-OHDA处理的早期PD大鼠黑质BDNF免疫反应阳性表达细胞数量和平均光密明显度增多，而黑质致密部NPY免疫反应阳性表达细胞平均光密度明显减少；而蝎源活性肽一定程度上逆转了异常的BDNF和NPY免疫反应阳性表达细胞的免疫反应活性(图1，表2，图1见彩图页Ⅱ)。单独蝎源活性肽对照组与假手术对照组相比，无明显差异，所以结果中未展示。

GroupBDNFNPYControl8.34±0.525.50±1.10PD14.00±0.894.00±0.05Scorpionvenom5.33±0.055.50±0.29

PD: Parkinson’s disease; BDNF: Brain-derived neurotrophic factor; NPY: Neuropeptide Y

3 讨论

PD是慢性神经系统变性疾病，常见于中老年人。发病主要是因为黑质多巴胺能神经元出现进行性变性。蝎源活性肽具有抗氧化活性并减轻PD动物线粒体损伤，进而保护多巴胺能神经元[11]。

BDNF在大脑内分布广泛，对多巴胺能神经元具有营养和保护作用。当多巴胺能神经元受到损伤时，可能引起其代偿性的表达增多，进而试图以此来保护多巴胺能神经元避免或加重其损伤。蝎源活性肽通过早期保护多巴胺能神经元后，降低了BDNF的这种代偿性的表达增多。NPY即神经肽酪氨酸，由36个氨基酸构成，是一种活性多肽，属于胰多肽家族，在脑内和胃肠道含量丰富。近年研究显示，采用PD药物治疗的神经保护作用的机制与BDNF密切相关。Baquet ZC 等[12]发现，BDNF对于中脑多巴胺能神经元的生存和分化有促进作用。BDNF能改善6-OHDA造成的PD大鼠黑质多巴胺能神经元数目减少及超微结构影响[13]。BDNF基因工程方法制备的PD大鼠模型，PD大鼠纹状体内DA代谢率显著降低，DA水平有所提高，改善了PD大鼠的主动活动性[14]。NPY在中枢神经系统中有广泛的表达，在重要的生理功能和病理条件如癫痫、慢性疼痛、焦虑和神经退行性疾病中起着重要的作用[15]。

临床上多采用影像学检测和回顾性PD患者尸检等方法[16]研究PD临床期。动物模型更适用于PD早期研究[13]。将6-OHDA注入脑内，改变注药部位和注药量的不同，可以模拟PD患者的病理改变，已被广泛用于PD研究[11]。基于前期研究发现，本研究观察早期PD模型的中脑内BDNF及NPY的表达情况，进一步观察蝎源活性肽的神经保护作用。这为早期PD的发病机制及诊治提供理论依据。

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国家自然科学基金(31201724)；辽宁省大学生科研创新活动(201310161008)

2015-12-01 【修回日期】2016-07-06

R742.5

A

1000-6834(2017)01-030-03

△【通讯作者】Tel: 0411-86110288; E-mail: dlshengming@163.com