钙调蛋白N2和C2突变体载体的构建、表达纯化和鉴定

晏珊，雷帅，陈思充，于佳慧，祝旭东，孙嘉瑶，杜逸，李墨，唐子鉴，郝丽英

（中国医科大学药学院药物毒理学教研室，沈阳110122）

钙调蛋白N2和C2突变体载体的构建、表达纯化和鉴定

晏珊，雷帅，陈思充，于佳慧，祝旭东，孙嘉瑶，杜逸，李墨，唐子鉴，郝丽英

（中国医科大学药学院药物毒理学教研室，沈阳110122）

目的构建钙调蛋白（CaM）N2和C2突变体的表达性载体，表达纯化并进行活性鉴定，为进一步研究CaM与钙通道片段的相互作用奠定基础。方法将CaM的N-lobe和C-lobe的cDNA分别与相应的N-lobe和C-lobe的cDNA相连，制备N2和C2突变体的cDNA。将N2和C2的cDNA分别插入pGEX-6p-3载体，并将重组质粒转入E.coliBL21菌株，IPTG诱导转化成功的菌株表达GST融合蛋白，超声破碎法提取，GS-4B beads纯化，SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白相对分子质量及纯度，pull-down实验鉴定活性。结果酶切鉴定以及DNA测序结果证实重组质粒构建成功；SDS-PAGE电泳图显示突变体蛋白纯度和浓度均较高；pulldown实验结果证明突变体蛋白有生理活性，能与钙通道片段结合。结论本研究成功构建了N2和C2表达质粒，并提取、纯化了有活性的钙调蛋白N2和C2突变体。

钙调蛋白；N-lobe；C-lobe；N2；C2；pull-down实验

钙调蛋白（calmodulin，CaM）是一种广泛存在于生物体内的Ca2+感受器，参与细胞的多种生理过程，如突触可塑性、肌肉收缩、细胞周期的调控、生物周期节律的调节等，尤其在Ca2+参与的信号通道的调节中更具有重要作用。

CaM是由2个高度同源的球型区域，即C-lobe和N-lobe，以及2个lobe之间呈α-螺旋的连接肽段组成，整体的空间结构呈哑铃状［1-2］。每个lobe都包含2个Ca2+结合位点（又称EF-hand），而每个EF-hand结构均能结合1个Ca2+，但C-lobe和N-lobe的Ca2+结合能力却有一定的差异［3］，有研究［4］表明，C-lobe与Ca2+的亲和力较N-lobe高。EF-hand与Ca2+结合后能使CaM上的疏水残基暴露，从而与多种靶蛋白相互作用，进一步发挥其生理作用［5］。因此，当CaM的Ca2+结合能力发生改变，能够极大地影响其正常生理功能的发挥。而CaM作为人体重要的Ca2+感受器，对心肌L型钙通道（L-type calcium channel，LTCC）的生理状态和活性的调节具有重要意义，当CaM发生突变导致其Ca2+结合能力发生改变时，会引起CaM与LTCC的亲和力发生显著变化，从而可能导致一系列的心血管疾病的发生［6-7］。通过SWISS-MODEL对N2（CaM的N-lobe取代其C-lobe，即，N-lobe-N-lobe）和C2（CaM的C-lobe取代其N-lobe，即，C-lobe-C-lobe）的结构进行模拟，发现两者与野生型CaM结构相似，且都具有与Ca2+结合的能力。为了更加深入地探讨CaM的N-lobe和C-lobe与LTCC结合的不同作用及机制，本研究拟构建并表达、提取和纯化有生理活性的CaM N2和C2突变体，为进一步揭示CaM的N-lobe和C-lobe结构功能的差异以及对LTCC和心血管疾病的影响奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

pGEX-6p-3/N2和pGEX-6p-3/C2重组质粒由武汉金开瑞生物工程有限公司合成；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）和二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）购自Biotopped公司；氨苄青霉素（ampicillin，AMP）购自宝莱克生物科技公司；GS-4B beads和PreScission Protease由GE Healthcare公司提供；溶菌酶购自Sigma公司。

1.2 重组质粒的转化和提取

1.2.1E.coliBL21感受态细胞的转化：采用42℃精确热激法将2种重组质粒转入感受态细胞，并用AMP进行筛选获得转化成功的重组BL21菌种，具体操作流程参考文献［8］。

1.2.2 重组质粒的提取：运用碱裂解法裂解细胞，并通过硅基质材料离心吸附柱在高盐状态下对DNA的特异性吸附提取纯化重组质粒DNA。具体实验过程按照天根生化科技（北京）有限公司提供的高纯度质粒小提中量试剂盒（DP107）说明书操作。

1.3 重组质粒的DNA鉴定

1.3.1 重组质粒DNA的酶切鉴定：重组质粒均具有SalⅠ和NotⅠ2个酶切位点，故采用双酶切法处理提取纯化获得的重组质粒DNA，然后行琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.3.2 重组质粒DNA的测序：将转化成功的菌液约1 mL提供给武汉金开瑞生物工程有限公司进行DNA测序。

1.4 蛋白的表达、提取纯化、浓度测定和纯度鉴定

1.4.1 蛋白的表达：取100 μL相应菌种加入到400 mL含AMP（50 μg/mL）的灭菌LB培养液中，100 r/min、37℃水浴振荡培养12～16 h。当菌液OD600在0.8～1.0之间时，加入IPTG（1 mmol/L），110 r/min、37℃水浴振荡培养4 h，诱导表达融合蛋白。

1.4.2 蛋白的提取和纯化：将诱导后菌液4 000 r/min离心10 min后，用预冷的PBS重悬沉淀（20 mL PBS/400 mL菌液），并加入溶菌酶（0.2 mg/mL）和DTT（10 mmol/L）冰上处理30 min，低温超声破碎20～30 min。超声后菌液4℃、15 000g离心10 min，上清与适量用PBS清洗后的GS-4B beads在4℃低速旋转孵育过夜。次日，用1 mol/L Tris Buffer（pH8.0）清洗结合后beads 3～4次，洗净后沉淀用495 μL Tris Buffer和5 μL PreScission Protease在室温下旋转酶切5 h，去除融合蛋白上的GST标签。酶切后800 r/min离心3 min，所得上清即为提纯的N2和C2蛋白，可直接用于蛋白浓度和纯度鉴定，或-20℃冻存待用。

1.4.3 蛋白浓度的测定：采用碧云天生物技术研究所提供的BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）测定蛋白浓度。

1.4.4 蛋白纯度的鉴定：行15%SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化后蛋白的相对分子质量及纯度。

1.5 蛋白活性的鉴定

应用pull-down实验方法，检测当N2和C2浓度分别为0.7、1.4、2.1、3.5、7.0、10 μmol/L时，与LTCC C-末端上能与野生型CaM结合的PreIQ片段的结合情况。反应体系300 μL，包括：40 μL固化于GS-4B beads上的GST-PreIQ，3 μL 1 mmol/L CaCl2，不同体积的N2和C2蛋白，以及1 mol/L Tris Buffer（pH8.0）。4℃低速旋转孵育4 h。然后用含10 μmol/L Ca2+的1 mol/L Tris Buffer（pH8.0）清洗沉淀，清洗后沉淀加入15 μL 1×SDS-Loading Buffer并煮沸5 min，上清用于SDS-PAGE电泳。电泳后凝胶用考马斯亮蓝染色1 h，脱色液脱色后，用扫描仪扫描照相。

2 结果

2.1 重组质粒的酶切鉴定

采用琼脂糖凝胶电泳pGEX-6p-3/N2和pGEX-6p-3/C2重组质粒进行鉴定。载体pGEX-6p-3约4 900 bp，载体上SalⅠ和NotⅠ酶切位点之间含有18 bp，pGEX-6p-3经SalⅠ和NotⅠ双酶切后分别插入N2（476 bp）和C2（452 bp）的DNA。因此，pGEX-6p-3/N2和pGEX-6p-3/C2重组质粒经SalⅠ和NotⅠ双酶切后应分别得到2个DNA片段，较大分子量的DNA片段约为4 882 bp，较小分子量的DNA片段约为476 bp（N2）和452 bp（C2）。N2和C2的酶切后琼脂糖凝胶电泳结果（图1）显示，在5 000和500 bp左右均有一明显的条带，表明实验结果与预期相符，说明2个重组质粒构建成功。

图1 重组质粒双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图Fig.1Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmids digested by restriction endonuclease

2.2 重组质粒的DNA测序结果

DNA测序结果显示，pGEX-6p-3/N2和pGEX-6p-3/C2重组质粒含有相应的2个重复的N-lobe（图2A、2B）和2个重复的C-lobe（图2C、2D）目的cDNA片段，且C-末端和N-末端插入方向正确，阅读框架正确，无移码现象，基因（图2）和氨基酸同一性比较达100%。进一步证明了本研究构建的N2和C2重组质粒取得了成功。

2.3 纯化后蛋白的浓度测定和纯度鉴定

采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定提纯的蛋白浓度，计算所得N2和C2蛋白的浓度分别为1.26和1.19 mg/mL，与相同条件下提取的野生型CaM的浓度（约1.0 mg/mL）相近，浓度较高，能满足后续实验的要求。

野生型CaM含有148个氨基酸（不计算起始的甲硫氨酸），其表观分子质量约为17 000，N2和C2与野生型CaM质量相近，理论计算值分别为17 200和16 400。对纯化后的蛋白行SDS-PAGE电泳，结果（图3）显示，在17 000左右可见明显的蛋白条带，条带清晰且杂带较少，表明纯化后的蛋白纯度较高；且N2蛋白条带较C2略大，与理论结果一致。

2.4 纯化后蛋白的活性鉴定

pull-down实验检测结果（图4）显示，合成的N2和C2蛋白在不同浓度下均能与LTCC C-末端片段PreIQ结合，且表现出与野生型CaM相似的特性［9］，即有一定的蛋白浓度依赖性。说明本实验所构建、提取纯化的N2和C2蛋白都保留了与钙通道蛋白结合的能力，为进一步研究奠定了基础。

3 讨论

CaM作为人体重要的Ca2+结合蛋白，在心脏、血管及骨骼肌的收缩和舒张过程中具有重要作用，它与Ca2+的结合能力和状态的改变能极大地影响其与靶蛋白（如心肌LTCC等）的亲和力。XU等［10］研究发现，在单通道膜片钳inside-out模式下，CaM能恢复钙通道的“run-down”现象。同时，本研究组也发现，CaM的单个lobe亦能独自恢复钙通道“rundown”现象，表明单个lobe也具有生理活性［11］，但不能单独引发钙通道的钙依赖性失活（Ca2+-dependent inactivation，CDI）。为了进一步探究CaM的2个lobe之间功能的差异，本研究应用基因重组技术首次构建了CaM突变体N2和C2重组质粒，并成功诱导、表达、提取纯化了大量有生理活性的蛋白，为后续研究奠定了基础。

图2 重组质粒DNA测序结果及相对应的氨基酸序列图Fig.2DNA sequence identification of recombinant plasmids and their amino acid sequence

图3 纯化后N2和C2蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图Fig.3SDS-PAGE of purified N2and C2

本研究选用在分子生物学研究中广泛运用的大肠杆菌原核表达系统进行了体外蛋白的表达和提取。大肠杆菌表达系统的最大优点在于遗传背景清楚，技术十分成熟，操作简单，成本较低，生产周期短且易于扩大化生产目的蛋白。本研究采用双酶切以及DNA测序的方法证实了重组质粒合成成功且基因序列正确；SDS-PAGE检测了纯化的N2和C2蛋白的相对分子质量及纯度；并用BCA蛋白浓度测定法证明了本研究所合成和纯化的蛋白浓度较高，能够用于后续实验；最后采用pull-down实验的方法验证了纯化后蛋白具有与野生型CaM相似的生理活性。综上所述，本研究所采用的方法能够稳定获得高浓度、高纯度且具有生理活性的N2和C2蛋白，为进一步探讨CaM N-lobe和C-lobe的生物学功能奠定了基础。

图4 N2和C2与GST-PreIQ的相互作用Fig.4Interaction of N2and C2with GST-PreIQ

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（编辑 王又冬）

Vector Construction，Protein Expression，Purification，and Identification of Calmodulin Mutants N2and C2

YAN Shan，LEI Shuai，CHEN Sichong，YU Jiahui，ZHU Xudong，SUN Jiayao，DU Yi，LI Mo，TANG Zijian，HAO Liying
（Department of Pharmaceutical Toxicology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo construct expression vectors of calmodulin（CaM）mutants N2and C2，and to express，purify，and identify the mutant proteins，in order to study the interactions between CaM and calcium channels.MethodsThe cDNA of N-lobe and C-lobe of CaM were used to prepare the cDNA of N2and C2.Next，the recombinant cDNAs were cloned into a pGEX-6p-3 plasmid，and the recombinant plasmids were transferred intoE.coliBL21 cells.The transfected BL21 cells were stimulated with IPTG.The fusion proteins were extracted by ultrasonication and purified by using GS-4B beads.Finally，protein activity was identified by the pull-down assay.ResultsBoth the restriction digestion map and the DNA sequence identification results confirmed that the recombinant plasmids were successfully constructed.SDS-PAGE results showed high purity and concentration of N2and C2proteins.Their activities and binding abilities with the calcium channel fragment were confirmed by the pull-down assay.ConclusionIn this study，expression vectors of N2and C2are successfully constructed，and physiologically active N2and C2CaM mutant proteins are obtained.

calmodulin；N-lobe；C-lobe；N2；C2；pull-down assay

R96

B

0258-4646（2017）05-0401-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.05.005

国家自然科学基金（31471091）；大学生创新计划项目（201610159052，201510159047，2015048，2015023）

晏珊（1990-），女，硕士研究生.

郝丽英，E-mail：lyhao@mail.cmu.edu.cn

2016-09-14

网络出版时间：