地塞米松对人牙周膜细胞白细胞介素6和白细胞介素8表达的调节作用

唐晓琳，潘春玲，李琛

（中国医科大学口腔医学院牙周科，沈阳110002）

地塞米松对人牙周膜细胞白细胞介素6和白细胞介素8表达的调节作用

唐晓琳，潘春玲，李琛

（中国医科大学口腔医学院牙周科，沈阳110002）

目的探讨地塞米松（Dex）对人牙周膜细胞（hPDLCs）中白细胞介素（IL）6和IL-8表达的调节作用。方法Dex或牙龈卟啉单胞菌（P.g）-脂多糖（LPS）分6组处理hPDLCs:10-9mol/L Dex组，10-6mol/L Dex组，10 μg/mLP.g-LPS组，10-9mol/L Dex+ 10 μg/mLP.g-LPS组，10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS组，0.1%无水乙醇（对照组）。分别用ELISA法和实时定量PCR法检测IL-6、IL-8蛋白和mRNA表达水平。结果24 h和48 h时，10-9mol/L Dex组和10-6mol/L Dex组IL-6和IL-8蛋白表达水平显著低于对照组（P＜0.05）。48 h时10-9mol/L Dex组和10-6mol/L Dex组hPDLCsIL-6mRNA水平显著低于对照组（P＜0.05）；而10-6mol/L Dex组IL-8mRNA的表达水平显著高于对照组（P＜0.05）。24 h和48 h时10-9mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS组和10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS组IL-6蛋白和mRNA表达水平显著低于10 μg/mLP.g-LPS组（P＜0.05）。24 h时10-9mol/L Dex+10 μg/mL P.g-LPS组和10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS组IL-8蛋白表达水平显著低于10 μg/mLP.g-LPS组（P＜0.05），但48 h未见统计学差异。48 h时，10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS组IL-8mRNA水平显著高于10 μg/mLP.g-LPS组（P＜0.05）。结论Dex可以显著抑制hPDLCs固有的和P.g-LPS诱导产生的IL-6的表达，但是Dex对hPDLCs IL-8的表达具有复杂的调节作用，需注意高浓度Dex长时间作用时对hPDLCs IL-8表达的促进作用。

地塞米松；糖皮质激素；牙周膜细胞；骨向诱导；白细胞介素6；白细胞介素8

牙周炎是一种发生在牙周组织的慢性炎症性疾病，主要特点是牙周袋形成和牙槽骨吸收。人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）是牙周组织的重要细胞，在特定条件下可以分化为成骨细胞，进而修复牙周组织。此外，hPDLCs在细菌及其毒力因子作用下可以分泌白细胞介素（interleukin，IL）6和IL-8等多种促炎性因子［1］。众所周知，糖皮质激素能够调节细胞分化和免疫炎症反应。地塞米松（dexamethasone，Dex）是一种常见的人工合成糖皮质激素。Dex主要用于牙周组织工程学研究，即诱导牙周膜干细胞骨向分化为成骨细胞［2-4］；其次，在牙周治疗中可作为止痛辅剂［5］。但是Dex对hPDLCs促炎性细胞因子表达的调节作用尚不清楚。本研究的目的是观察Dex和牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g）-脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）对hPDLCs IL-6和IL-8表达水平的调节作用，从而为Dex的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

Dex（美国Sigma公司）；胎牛血清（德国PAA公司）；活性炭处理胎牛血清（天津灏洋生物制品技术有限公司）；DMEM培养基（美国GIBCO公司）；ELISA试剂盒、Trizol试剂盒和反转录试剂盒（美国Invitrogen公司）；P.g-LPS（中国医科大学口腔医学院牙体牙髓科仇丽鸿教授惠赠）；酶标仪（美国Bio Rad公司）；实时定量PCR试剂（日本Takara公司）。

1.2 hPDLCs原代培养

细胞来源于3名正畸治疗患者的前磨牙。术前获得患者的知情同意。采用组织块法行hPDLCs原代培养［6］。个体来源细胞培养至第3代后混合，进行传代培养和后续实验。

1.3P.g-LPS提取

热酚水法提取P.gATCC 33277 LPS，冻干得LPS精制品，-70℃冻存备用。

1.4 Dex和P.g-LPS处理方法和分组

Dex溶解于无水乙醇中，-70℃冻存备用。消化第4代细胞，2×104/孔接种于24孔板（为第5代），在去酚红DMEM培养基和5%活性炭处理的胎牛血清中培养至第8天，分为6组处理：10-9mol/L Dex组，10-6mol/L Dex组，10 μg/mLP.g-LPS组，10-9mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS组，10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS组，对照组（培养基中加入0.1%无水乙醇），每组重复6孔。

1.5 ELISA法检测hPDLCs IL-6和IL-8蛋白的表达水平

在上述处理24 h和48 h时收集培养基，1 000 r/min、4℃离心15 min，取上清液，-70℃冻存待检。依据IL-6和IL-8试剂盒说明，ELISA法检测上清液中的IL-6和IL-8含量。酶标仪450 nm波长读取光密度值，根据标准曲线计算上清中IL-6和IL-8含量。

1.6 实时定量PCR法检测IL-6和IL-8mRNA表达水平

各种因素处理细胞48 h，按照试剂盒说明，用Trizol试剂裂解细胞并提取细胞总RNA，反转录试剂盒反转录为cDNA，实时定量PCR法检测IL-6和IL-8mRNA表达水平，GAPDH做为内参照。引物序列：IL-6，上游引物5’-GGAGACTTGCCTGGTGAAA-3’，下游引物5’-CAGGGGTGGTTATTGCATCT-3’，产物片段179 bp；IL-8，上游引物5’-AGCTCTGTGTG AAGGTGCAG-3’，下游引物5’-AATTTCTGTGTTGG CGCAGT-3’，产物片段148 bp；GAPDH，上游引物5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物5’-GAA GATGGTGATGGGATTTC-3’，产物片段226 bp。目的基因mRNA表达水平的计算方法为相对定量法，计算公式为2-ΔΔCT。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 Dex对hPDLCs固有IL-6和IL-8表达的调节作用

10-9mol/L Dex组和10-6mol/L Dex组IL-6蛋白表达水平显著低于对照组（均P＜0.001），24 h时分别为对照组的42.52%和15.49%，48 h分别为对照组的23.86%和6.59%。48 h时，10-9mol/L Dex组和10-6mol/L Dex组IL-6mRNA表达水平显著低于对照组（均P＜0.001），分别为对照组的53.10%和10.13%。见表1。

10-9mol/L Dex组或10-6mol/L Dex组IL-8蛋白表达水平显著低于对照组（均P＜0.001），24 h时分别为对照组的32.51%和24.67%；48 h分别为对照组的37.77%和53.84%。48 h时10-6mol/L Dex组IL-8mRNA表达水平显著高于对照组（P=0.016），为对照组的2.74倍。见表1。

2.2P.g-LPS对hPDLCs IL-6和IL-8表达的调节作用

10 μg/mLP.g-LPS组IL-6蛋白表达水平显著高于对照组（均P＜0.001），24 h时为对照组的9.08倍，48 h时为对照组的4.82倍。48 h时10 μg/mLP.g-LPS组IL-6mRNA的表达水平显著高于对照组（P＜0.001），为对照组的8.97倍。见表1。

10 μg/mLP.g-LPS组IL-8蛋白表达水平显著高于对照组（均P＜0.001），24 h时为对照组的28.15倍，48 h为对照组的37.53倍。48 h时10 μg/mLP.g-LPS组IL-8mRNA的表达水平显著高于对照组（P＜0.001），为对照组的74.64倍。见表1。

2.3 Dex和P.g-LPS联合作用对hPDLCs IL-6和IL-8表达的影响

10-9mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS组或10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS组IL-6蛋白的表达水平均显著低于10 μg/mLP.g-LPS组（均P＜0.001），24 h时分别为10 μg/mLP.g-LPS组的72.00%和37.30%，48 h时分别为10 μg/mLP.g-LPS组的84.64%和 66.85%。48 h时10-9mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS组（P=0.014）和10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS组（P=0.009）IL-6mRNA表达水平显著低于10 μg/mLP.g-LPS组，分别为10 μg/mLP.g-LPS组的38.56%和27.03%。见表1。

24 h时10-9mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS组或10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS组IL-8蛋白的表达水平均显著低于10 μg/mLP.g-LPS组（均P＜0.001），分别为10 μg/mLP.g-LPS组的68.29%和69.45%。但48 h时，Dex对10 μg/mLP.g-LPS诱导产生的IL-8蛋白表达未见显著作用。48 h时10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS组IL-8mRNA表达水平显著高于10 μg/mLP.g-LPS组（P＜0.001），为10 μg/mLP.g-LPS单独作用的3.95倍。见表1。

表1 Dex和P.g-LPS对hPDLCs IL-6和IL-8蛋白表达的调节作用Tab.1Effects of Dex and P.g-LPS on IL-6 and IL-8 protein expression in hPDLCs

3 讨论

Dex在牙周领域的应用主要为诱导牙周干细胞骨向分化，很少用于治疗牙周炎症反应。笔者推测，局部应用Dex可以避免全身应用的诸多不良反应［7］，一方面能够诱导hPDLCs细胞骨向分化，另一方面可以发挥调节炎症反应的作用。但是局部应用Dex对牙周炎的调节作用尚存在争议［8-9］。本研究以hPDLCs为研究对象，探讨Dex对促炎性因子表达的调节作用和剂量选择。

IL-6积极参与牙周炎的发生发展过程，具有促进破骨细胞成熟、抑制牙周膜再生、促进炎症反应等多项功能。本研究发现，Dex强烈抑制hPDLCs固有的和P.g-LPS诱导产生的IL-6蛋白和mRNA的表达，从而可能抑制牙周炎症反应。NEBEL等［10］的研究发现，Dex显著抑制大肠杆菌LPS诱导的hPDLCs IL-6的表达，但是未探讨Dex对hPDLCs固有IL-6表达的调节作用。此外，NEBEL等［10］的研究中未发现1～5 μg/mLP.g-LPS对hPDLCs的调节作用，本研究预实验发现10 μg/mLP.g-LPS能显著促进hPDLCs IL-6蛋白和mRNA的表达，且与更高浓度LPS组比较细胞的状态未发生显著变化，因此选择该浓度。多项研究结果显示，P.g-LPS通过多种途径促进IL-6的表达，包括丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路［11］、核因子κB通路［12］、miRNA-146分子［13］等。ANTON等［14］发现Dex能够抑制MAPK的活化，进而抑制LPS刺激绒毛外滋养细胞IL-6和IL-8的表达。但是在hPDLCs中，Dex调节IL-6表达的具体途径还需要深入研究。

IL-8是人白细胞趋化和活化因子家族成员，研究证实IL-8在牙周炎的炎症进程中发挥重要作用［15-16］。本研究结果显示，Dex对IL-8具有复杂的调节作用。本研究发现，Dex对hPDLCs固有IL-8蛋白有显著的抑制作用，但是48 h时高浓度（10-6mol/L）Dex组IL-8蛋白和mRNA表达水平显著高于10-9mol/L Dex组，IL-8mRNA水平显著高于对照组。此外，虽然Dex作用24 h显著抑制P.g-LPS诱导产生的IL-8蛋白水平，但是48 h时Dex对P.g-LPS诱导产生IL-8蛋白的抑制作用消失，且10-6mol/L Dex强烈促进P.g-LPS诱导IL-8mRNA的表达。

本研究中，培养基上清液中检测到的IL-8蛋白和细胞中IL-8mRNA表达的趋势不甚一致，主要是由检测方法导致。本研究中通过ELISA法检测培养基上清中的IL-8水平，由于早期Dex对细胞IL-8蛋白的显著抑制作用，导致Dex组上清液中IL-8水平较低，而随后Dex虽然可能促进了IL-8蛋白的表达，但是未能抵消原有的抑制量，所以未能检测出Dex对IL-8蛋白的促进作用。此外，本研究发现48 h时10-6mol/L Dex组IL-8蛋白和mRNA水平都显著高于10-9mol/L Dex组，且Dex对LPS诱导产生IL-8蛋白的抑制作用消失，也可以提示48 h时10-6mol/L Dex对IL-8蛋白表达的促进作用。根据LEE等［17］的报道，Dex能显著抑制MAPK途径，进而抑制hPDLCs中肿瘤坏死因子α诱导IL-8的表达，但是仅检测了24 h时间点，未对48 h时间点进行检测，因此无法与本研究的结果类比。此外，SADIKOT等［18］研究显示，高剂量Dex能够增强内毒素处理小鼠核因子κB活性，从而促进炎症发生。AGRAWAL等［19］的研究发现，Crohn病患者全身应用Dex能够增加腹腔内和盆腔内脓肿的危险性。根据本研究结果，Dex对IL-8表达的调节具有双向作用。短时间内Dex可能抑制IL-8的表达，而高浓度Dex长时间作用可能促进内源性和LPS诱导的IL-8的表达，但是具体机制还需要深入研究。

本研究中应用的特定实验条件考虑了如下因素。本研究在细胞培养至第8天后施加各种处理因素，此时细胞生长已到达平台期，可以排除Dex对细胞生长的影响。Dex是骨向诱导剂的重要成分，以往研究报道的浓度范围为10-9～10-6mol/L，因此本研究应用这一浓度范围处理细胞。研究中采用去酚红DMEM培养基和活性炭处理胎牛血清，能够最大限度降低培养体系中激素对实验结果的影响。为了增强可比性，24 h和48 h的检测结果均来源于同一批细胞。所以仅在处理结束即48 h时，对裂解细胞进行了mRNA检测。

综上所述，Dex能够显著抑制IL-6的表达，从而可能抑制牙周炎症反应。但是，Dex对IL-8的调节作用较为复杂，具有双向性，特别是高浓度Dex长时间作用可能促进IL-8的表达进而可能促进炎症反应。因此，在临床应用时需要注意Dex的合理浓度范围。今后尚需研究Dex对hPDLCs IL-6和IL-8表达调节的具体机制，并探讨体内应用方式。

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（编辑 陈姜）

Effect of Dexamethasone on the Expression of Interleukin-6 and Interleukin-8 in Human Periodontal Ligament Cells

TANG Xiaolin，PAN Chunling，LI Chen
（Department of Periodontology，School of Stomatology，China Medical University，Shenyang 110002，China）

ObjectiveTo explore the effect of dexamethasone（Dex）treatment on the expression of interleukin（IL）-6 and IL-8 in human periodontal ligament cells（hPDLCs）.MethodshPDLCs were subjected to one of the following treatments for 24 h or 48 h:10-9mol/L Dex；10-6mol/L Dex；10 μg/mLPorphyromonas gingivalis（P.g）-lipopolysaccharide（LPS）；10-9mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS；10-6mol/L Dex+10 μg/mL P.g-LPS；or 0.1%absolute ethyl alcohol（control）.Protein and mRNA expression was detected using ELISA and real-time PCR，respectively.ResultsAt 24 h and at 48 h，IL-6 and IL-8 protein expression in the 10-9mol/L Dex-and 10-6mol/L Dex-treated groups was significantly lower than that in the control group（P＜0.05）.At 48 h，IL-6mRNA expression in the 10-9mol/L Dex-and 10-6mol/L Dex-treated groups was significantly lower than that in the control group（P＜0.05），whileIL-8mRNA expression in the 10-6mol/L Dex-treated group was significantly higher than that in the control group（P＜0.05）.At 24 h and at 48 h，IL-6 protein and mRNA expression in the 10-9mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS-treated group and the 10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS-treated group was significantly lower than that in the 10 μg/mLP.g-LPS-treated group（P＜0.05）.At 24 h，IL-8 protein expression in the 10-9mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS-treated group and the 10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS-treated group was significantly lower than that in the 10 μg/mLP.g-LPS-treated group（P＜0.05），while no such significant difference existed at 48 h.At 48 h，IL-8mRNA expression in the 10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS-treated group was significantly higher than that in the 10 μg/mLP.g-LPS-treated group（P＜0.05）.ConclusionDex inhibits the innate andP.g-LPS-induced expression of IL-6 in hPDLCs.However，Dex exerts profound effects on IL-8 expression，and treatment with high doses of Dex may promote IL-8 expression over an extended period.

dexamethasone；glucocorticoid；periodontal ligament cell；osteogenic induction；interleukin-6；interleukin-8

R781.4

A

0258-4646（2017）05-0449-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.05.016

中国博士后科学基金（20090461190）

唐晓琳（1973-），女，副教授，博士. E-mail：xltang@cmu.edu.cn

2016-12-29

网络出版时间：