基于核酸适配子的循环肿瘤细胞检测研究进展*

周建明 王 婷 张焜和

·国家基金研究进展综述·

基于核酸适配子的循环肿瘤细胞检测研究进展*

周建明 王 婷 张焜和

循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）是从肿瘤病灶脱落后进入血液循环的肿瘤细胞，在肿瘤的微转移检测、病情评估、疗效及预后评判等方面具有重要价值，但因其在血液中数量极少，难以检测，临床应用进展缓慢。近年来，随着生物学技术的不断发展，CTC的富集及检测新方法不断进步，其中基于核酸适配子的富集及检测方法不但能快速高效捕获和无损释放CTC，还能定性、定量分析CTC，甚至能检测出血液中的单个CTC和不同亚群的肿瘤细胞，具有良好的应用前景。

适配子循环肿瘤细胞无损捕获高效检测可视分析

循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）是从肿瘤原发灶或转移灶中脱落并进入血液循环的肿瘤细胞。CTC检测在肿瘤的微转移发现、病情评估、个体化治疗及术后复发监测等方面具有重要价值。CTC在外周血中含量稀少，106～107个有核细胞中仅有1个［1］。近年来随着生物学技术的迅速发展，CTC的富集及检测技术不断进步，其中基于抗体的CTC检测已较成熟，同时抗体联合纳米材料、微流体装置等检测新技术不断发展。核酸适配子（简称适配子）是生物分子的人工单链寡核苷酸配体，通过体外筛选获得，以构象适配机制与靶分子高特异性、高亲和力结合，相较于抗体具有独特优势。基于适配子的CTC捕获与分析显示出良好的应用前景，本文就这一领域的研究进展进行综述。

1 适配子及其分子识别特性

适配子是长度为25～80个碱基的单链寡核苷酸。1990年，建立指数富集的配体系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术，通过该项技术，可在人工合成的随机单链寡核苷酸文库中筛选、扩增和富集能与靶分子高特异性、高亲和力结合的特定核酸序列，即适配子［2-3］。

单链寡核苷酸可自然形成发夹（hairpin）、凸环（bulge）、假结（pseudoknot）、G-四分体（G-quartet）等二级结构，从而使适配子具有特定的分子构象。当适配子与生物分子的分子构象相互匹配形成“锁钥”关系时，即可特异性识别靶分子，并通过分子之间的作用力而结合靶分子，其亲和力能达到纳摩尔甚至皮摩尔水平。

适配子与靶分子的特异性结合类似于抗体与抗原的结合，但与抗体相比，适配子具有如下优势：1）适配子的靶分子比抗体范围广，小分子如腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、毒性分子均可作为靶标筛选相应的适配子；2）适配子为核酸分子，具有热稳定性、可人工合成、易于修饰改造、无免疫原性、可通过PCR扩增、可被核酸酶降解等优点。

2 基于适配子的CTC捕获与分析

2.1 适配子可捕获并无损释放CTC

适配子不仅能识别蛋白质等生物分子，也能通过细胞表面分子特异性识别细胞［4-5］。将适配子与磁珠偶联，通过磁选分离可从血细胞中分离出相应的靶细胞，联合表面增强拉曼光谱显像技术，可对靶细胞进行富集、分离和检测，且具有简便、快速的优点［6］。但其捕获率在缓冲液和血样中分别为73%、55%，尚有提升的空间。

将捕获到的CTC无损释放有利于后续进行细胞表型及功能分析，对恶性肿瘤的诊断及个体化治疗有重要价值。利用适配子的互补序列，将适配子的茎环结构打开，使捕获到的靶细胞脱落，可实现适配子与靶细胞的无损分离［7］，其不足之处是其释放率不高。Li等［8］通过修饰有特异性适配子的水凝胶捕获靶细胞后，利用限制性内切酶BamH I切割特定的位点，使靶细胞释放，释放率可达到99%，细胞活力可达到98%。

2.2 应用适配子直接检测CTC

基于抗原-抗体特异结合的CTC检测，必须了解肿瘤细胞表面标记物后才能应用相应的抗体进行检测，以适配子代替抗体可以弥补这一缺陷。以肿瘤细胞为靶标直接进行SELEX筛选，在不了解肿瘤细胞表面标记物的情况下也能筛到特异性适配子用于CTC捕获。Zhang等［9］筛选到适配子BC15用于捕获外周血中的胰腺癌细胞，与抗细胞角蛋白抗体的捕获结果比较差异无统计学意义（阳性率73%vs. 80%），具有显著相关性（r=0.810）。Zamay等［10］筛选到的适配子LC18捕获外周血中的肺癌细胞，敏感性为86%，特异性为76%。

2.3 适配子联合纳米材料可高效检测CTC

纳米粒子具有小尺寸效应、高比表面积等诸多优点，使之能够用于检测CTC［11］。Wan等［12］设计的具有纳米纹理的聚二甲硅氧烷基板，由于纳米纹理增加了基板表面的粗糙程度，有利于适配子与靶细胞的特异结合，捕获效率增强了约5.5倍。也有研究通过引入表面粗糙程度不同的金纳米层，发现对靶细胞的捕获效率比对照组高19倍［13］。这类方法在增加受检样品停留时间的同时，也增加了适配子与非特异性细胞接触的机会，捕获的特异性有所下降。

适配子本身带有一定的负电荷，如果反应表面引入的适配子数量越多，所产生的空间位阻效应也越大，真正发挥有效作用的适配子反而减少。一些高分子化合物，如POEGMA［13］、树状分子［14］，由于有很多的分支结构，适配子可以通过羟基或酰胺基结合到这些分支的末端，通过这些“连接器”的作用，纳米材料所能固化的适配子数量将扩展成一个立体的空间结构，极大增加了检测能力。

2.4 适配子联合微流体装置可快速检测CTC

以适配子构建适配子微流体装置，特别是将不同适配子固化于同一微流体，可以达到对不同类型靶细胞的特异性捕获，不论是敏感性还是捕获靶细胞的纯度都与传统的抗体微流体无显著性差异［15］。

许多研究致力于优化适配子联合微流体装置对靶细胞的捕获，包括速率的精准控制［16］、装置结构的优化［17］、空间位阻效应的减轻等。Sheng等［17］通过引入金纳米粒子增加固化的适配子数量，并用聚乙二醇对适配子进行修饰以减少空间位阻效应，将S形通道改装成纳米级别的“人”字形凹槽以增加血样与适配子接触的时间。发现以1.5 μL/s的速率通过时，捕获效率可达到93%，而用已知的蛋白酪氨酸激酶抗体进行对照，捕获率不足80%；值得注意的是，利用此装置联合适配子对7.5 mL血液标本进行检测，只需42 min就可完成，相对于CellSearch系统需要3～4 h，极大缩短了检测时间［18］。由于适配子与血液标本接触的时间决定了该方法的特异性及检测效率，故需要精准的速率控制装置，增加了制作难度及成本。

2.5 适配子联合荧光标记技术对CTC的可视性分析

由于荧光能更直观、形象地观察，在众多领域有着广泛的应用。Zeng等［19］在适配子的5'端和3'端分别连接荧光物质和淬灭剂，当适配子与靶细胞结合并被靶细胞内化，溶酶体核酸酶将适配子降解，荧光基团和淬灭剂分离，发出荧光，从而可视性检测到CTC。该项技术简单、方便，而且检测的细胞仍保持一定的活力，可进行细胞表型鉴定和功能分析等后续研究。不仅荧光，化学发光法也可用于检测CTC。Bi等［20］采用双适配子识别靶细胞，以鲁米诺-过氧化氢-对碘苯酚发光系统放大信号，可直观地观察到靶细胞，不仅可定性还可定量分析检测到的肿瘤细胞。2.6适配子联合电化学方法可突破单个CTC的检测

近年来，基于适配子的电化学方法检测肿瘤细胞被广泛研究。Qu等［21］通过酰胺结合将两个肝癌特异适配子TLS1c和TLS11a引入到玻璃碳电极上，两个适配子分别通过单链和双链的核酸“连接器”与玻璃碳电极相连，其中单链连接的适配子具有更大的自由度，使得整个装置在特异性和敏感性上都有很大提高，能在109个血细胞中检测到单个肿瘤细胞。Wang等［22］使用涂有二氧化硅层的微电极，其上面固化有表皮生长因子受体的适配子，待检样品通过时，通过测量捕获靶细胞后电压及电阻的变化实现对肿瘤细胞的计数。适配子联合电化学方法检测CTC技术已突显出其敏感性优势，但需要优化检测背景值及减少空间位阻效应才能发挥最佳检测效果。

2.7 多种适配子联合应用可实现CTC的亚型分析

氧化石墨烯是在石墨烯的基础上引入氧官能基团，使之不仅保留了石墨烯的层状结构，还表现出了胶体、薄膜以及两性分子等诸多石墨烯没有的特性［23］。Viraka等［24］在多微孔的氧化石墨烯膜上固化不同的适配子，能捕获不同类型的靶细胞，捕获率可达到95%；联合多重荧光显像技术可对捕获的靶细胞进行精准分析。但该方法对适配子的特异性要求较高，且适配子之间是否会形成新的二级结构尚不明确。Zhao等［25］利用细胞SELEX技术筛选到一些与非小细胞肺癌特异结合的适配子，利用适配子之间的协同效应，可加强适配子对血液中的非小细胞肺癌细胞部分亚型的捕获，明显优于利用抗体对CTC的检测。Labib等［26］创新性地利用适配子及反义核酸介导的二维分离法根据细胞表面抗原表达量的不同而分离出多种亚型，并证明了各种亚型具有不同的性能，为CTC的亚型精准分析提供了有效的方法。

3 结语

CTC检测对肿瘤的诊断、病情评估、预后及个体化治疗都有着重要的作用。适配子作为一种具有独特优势的“化学抗体”，在医学检测具有良好的应用前景。基于适配子的CTC检测技术具有良好的特异性及敏感性，使之成为更有效的CTC检测方法。基于适配子的检测工具可重复使用［27］，较传统抗体节省了成本。同时由于适配子精准的识别能力，可以区分细胞亚型，若能筛选出特异性较好的适配子，有助于解决肿瘤细胞异质性的检测问题，更有利于癌症的个体化治疗。生物医学、材料学等多学科的参与可更有效地发挥适配子的作用，特别是纳米技术及微流体技术的引入，对实现更快、更简单、更经济的CTC检测起到了重要的推动作用。基于适配子的CTC捕获作为一项新技术，尚处于研究阶段，在捕获效率等方面存在一些不足，通过筛选性能良好的适配子、优化捕获过程和捕获条件等将有助于克服这些缺陷。

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（2016‐08‐05收稿）

（2017‐04‐01修回）

（编辑：武斌校对：郑莉）

Advancement of aptamer-based detection for circulating tumor cells

Jianming ZHOU,Ting WANG,Kunhe ZHANG

Kunhe ZHANG;E‐mail:yfyzkh@sina.com

Department of Gastroenterology,The First Affiliated Hospital of Nanchang University Jiangxi Institute for Digestive Diseases,Nanchang 330006,China

Circulating tumor cells(CTCs)are cancer cells shed from tumor into blood circulation.These cells are valuable in micrometa‐static detection,disease assessment,and therapy and prognosis prediction of tumors.However,the clinical application of CTCs pro‐gresses slowly due to its rarity in the blood and difficulty for detection.Given the development of biological techniques,scholars have developed several new methods for enrichment and detection of CTCs.Aptamer‐based method shows a good prospect in CTC applica‐tion.In this method,CTCs can be rapidly and efficiently captured,nondestructively released,and qualitatively and quantitatively ana‐lyzed.This method can also be used to detect single and sub‐groups of CTCs.

aptamer,circulating tumor cell,nondestructive capture,efficient detection,visible analysis

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.08.918

周建明专业方向为消化道肿瘤的分子诊断。E-mail：zjmlml666@163.com

南昌大学第一附属医院消化内科，江西省消化疾病研究所（南昌市330006）

*本文课题受国家自然科学基金项目（编号：81560479）、江西省科技支撑计划（编号：20133BBG70025）和江西省教育厅科技落地计划（编号：KJLD13014）资助

张焜和yfyzkh@sina.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81560479),the Science and Technology Pillar Pro‐gram of Jiangxi Province(No.20133BBG70025),and the Science and Technology Landing Program of the Department of Education of Jiangxi Province(No.KJLD13014)