禽霍乱病原体的分离鉴定及药敏试验

顾 琪吉春粉鲁 洋

(1.江苏省兴化市畜牧兽医站,江苏兴化 225700; 2.江苏省兴化市合陈畜牧兽医站,江苏兴化 225700)

禽霍乱病原体的分离鉴定及药敏试验

顾 琪1吉春粉2鲁 洋2

(1.江苏省兴化市畜牧兽医站,江苏兴化 225700; 2.江苏省兴化市合陈畜牧兽医站,江苏兴化 225700)

本文通过对某蛋鸡场的疑似禽霍乱发病鸡进行采集病料，经过革兰氏和瑞氏染色涂片镜检、细菌的无菌分离培养、生化试验、动物致病性试验，确诊该批鸡患有禽霍乱。后对其进行药敏试验，结果显示分离到的禽多杀性巴氏杆菌对环丙沙星和恩诺沙星高度敏感，对青霉素钾和土霉素耐药。为该病的诊断和防控提供了依据。

禽霍乱 多杀性巴氏杆菌A 病原分离鉴定 药敏试验

禽霍乱是由多杀性巴氏杆菌A型引起的家禽和野禽一种接触性烈性传染病。该病通常呈急性败血性经过和剧烈下痢，死亡率高，各种类型的禽均可感染并导致死亡。最急性型无任何临床症状，死后尸体外表和内脏均无明显变化；急性型临床上出现无神、厌食和腹泻等症状，死后可见败血症变化，器官、组织表现出血性炎症。目前，该病在我国各地均有发生，是危害我国养禽业发展的重要疫病之一。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料

从鸡场无菌取疑似禽霍乱病鸡血液、肝脏、脾脏组织作为被检材料。试验用小白鼠购自医学院实验动物中心。

1.1.2 培养基

普通琼脂平板、血琼脂平板、肉汤培养基，生化培养基为本实验室自制。

1.1.3 药敏纸片

恩诺沙星、红霉素、卡那霉素、链霉素、土霉素、青霉素钾、庆大霉素、复方新诺明、环丙沙星、诺氟沙星，购自生物药店。

1.2 方法

1.2.1 发病情况

2012年5月份，某蛋鸡场5000余只在无任何前期临床症状下，鸡群突然出现大批死亡，第1 d死亡量在百余只。第二日鸡群死亡量继续增加，并相继出现腹泻，精神沉郁，鸡冠和肉髯肿胀、发绀，采食量减少，产蛋率下降，呼吸困难，口鼻分泌物增加，排白色水样或淡绿色稀粪等现象，个别鸡还出现呼吸困难等症状。

1.2.2 病理变化

对病死鸡进行剖检，观察各组织器官的病理变化。

1.2.3 细菌形态学

无菌取病死鸡心血、肝脏、脾脏等组织涂片，分别进行革兰氏和瑞氏色染色后镜检。

1.2.4 细菌分离

无菌取病死鸡心血、肝脏、脾脏分别接种普通琼脂平板、血琼脂平板培养基，37℃培养24 h后观察细菌的生长情况及菌落特征，取生长良好的菌落接种于血琼脂斜面待鉴定。取上述纯培养菌涂片，经亚甲蓝染色后观察细菌形态，取所分离细菌接种于肉汤培养基，37℃恒温培养24h后作为供试菌液。取菌液分别腹腔接种健康小白鼠5只，每只0.3 ml；另设对照小白鼠5只，腹腔注射营养肉汤。观察结果，如出现发病或死亡立即进行涂片镜检和细菌分离培养。

1.2.5 药敏试验

用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板6O°，最后沿平板内缘涂抹1周，将平板置室温下干燥5 min；用镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心距离大于24 mm，纸片距离平板内缘大于15 mm。置37℃培养16h，观察结果。

1.2.6 体外最低抑菌浓度（MIC）的测定

每种药物需要10支无菌试管：第1管加肉汤1.9ml，其余各管加1.0ml；取已制备好的药液，用吸管吸取0.1ml加入第1管中，充分混匀后吸取1.0 ml加入到第2管中，充分混匀后吸取1.0ml加到第3管中，依次进行倍比稀释到第9管，充分混匀后吸取1.0 ml弃去；第10管不加药液作为空白对照。向各管内加入已制备好的菌液0.05 ml，混匀后，放入37℃温箱中培养18 h，观察结果。没有细菌生长（培养液澄清）的药液最大稀释倍数即为最低抑菌浓度（MIC）。

2 结果

2.1 病理变化

剖检可见病鸡鸡冠、肉髯发绀，嗉囊中有食物。心包腔蓄积有淡黄色的液体。冠状脂肪及心外膜有大小不一的出血点和出血斑。肝肿大，质脆，呈棕黄色，表面分布针尖大小的灰黄色或灰白色的坏死灶。胃肠道中的变化以十二指肠的最突出，呈明显的卡他-出血性炎的变化，黏膜红肿，有出血点或出血斑。腺胃与肌胃交界处有条纹状的出血斑。蛋鸡卵泡变形，有严重的充血出血，呈半煮熟状或空卵泡。死鸡的输卵管内有软皮蛋、破壳蛋。

2.2 形态特征

革兰氏染色可见阴性，单个或成对的短杆菌，瑞氏染色成典型的两极着色。

2.3 菌落特征

分离菌在普通琼脂平板培养基上生长贫瘠，形成细小的菌落；在血琼脂平板培养基上生长良好，经37℃培养24 h可见淡灰白色、边缘整齐、表面光滑、闪光的露珠样小菌落，直径为1～2 mm，菌落周围无溶血现象。

2.4 理化特性

对病料的理化特性做了生化试验，结果详见表1。

表1 生化试验结果

从表1中可以看出该菌能发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、木糖、乳糖，产酸不产气；不能发酵鼠李糖、肌醇、侧金盏花，不产生H2S；MR试验、VP试验阴性。该结果基本与巴氏杆菌生化特征相符合。

2.5 动物致病性试验结果

将病料做了动物试验，结果详见表2。

表2 动物致病性试验结果

试验组小白鼠精神沉郁，腹泻，排出黄色、灰白色或绿色的稀粪，渴欲增加，口、鼻分泌物增多，且在l8～24 h内相继死亡。取试验组死亡小白鼠的心血、肝、脾、肺等病料触片染色镜检并进行细菌分离培养，镜检可见革兰氏染色为阴性短杆菌，亚甲蓝染色呈两极着色。细菌分离培养后可见到典型的禽多杀性巴氏杆菌的菌落特征。对照组小白鼠饲养观察7 d均健活。

2.6 药敏试验结果

选择了10种抗菌药做了药敏试验，结果详见表3和表4。

表3 10种抗菌药物的抑菌圈与敏感标准

表4 10种药物对禽巴氏杆菌的体外抑菌活性结果

从表4可以看出，分离到的禽多杀性巴氏杆菌对环丙沙星和恩诺沙星高度敏感，对复方新诺明、硫酸卡那霉素、硫酸庆大霉素、硫酸链霉素、甲砜霉素和诺氟沙星6种药物中度敏感，对青霉素钾和土霉素耐药。对复方新诺明的敏感性与选用的培养基密切相关，用含蛋白胨培养基培养时，复方新诺明对禽多杀性巴氏杆菌有较强的体外抗菌活性，而用无蛋白胨培养基培养时，复方新诺明对禽多杀性巴氏杆菌的体外抗菌活性明显增强。

2.7 抗菌药MIC值的测定结果

设计了抗菌药的MTC值的判定标准，并做了检测，结果详见表5和表6。

表5 抗菌药MIC值的测定结果及判定标准

表6 10种药物对禽巴氏杆菌的体外抑菌活性结果

从表6中可以看出各种抗菌药物的MIC值从大到小依次为土霉素、青霉素钾、复方新诺明、甲砜霉素、庆大霉素、链霉素、卡那霉素、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星。

3 讨论

该鸡场发生本病后，曾用抗生素类药物进行治疗，但是效果不佳，说明禽多杀性巴氏杆菌比较容易产生耐药性，进行药物治疗难以根除此病，因此也就增加了生产成本。所以在治疗时应及时使用敏感药物，从而避免耽误治疗时机。

由于禽霍乱、鸡伤寒和鸡新城疫的临床症状和剖检病理变化比较相似，因此在诊断上应注意区别。鸡伤寒是由鸡沙门氏菌引起的家禽的败血性传染病，多发生于3周龄以上的青年鸡和成年鸡，而禽霍乱则很少在16周龄以下发生，鸡伤寒一般病程较长，腹泻严重，常见到肝脏肿大，呈绿褐色或青铜色，表面有粟粒状灰白色病灶，同时还有脾肿大、胆囊肿大并充满绿色油状胆汁等病变，而禽霍乱则不显著；鸡新城疫是由新城疫病毒引起的疾病，具有很高的传染率、发病率和死亡率，一年四季均可发生，显微镜不可见病源，临床表现有消化道和神经症状，剖检可见嗉囊充满食物，口腔、食道和嗉囊内黏液比较多，腺胃乳头出血明显，胰腺常有小出血点或小坏死灶，肝脏变化不明显，抗生素和磺胺类药物治疗无效，常采用紧急接种方法，也可用高免血清或干扰素肌注进行治疗，可与禽霍乱相区别。如要确诊，应进一步进行细菌学检查。

同时，饲养场应建立良好的饲养管理和卫生防疫制度，制定严格的消毒方案，加强对引进种禽的检疫，杜绝其他家畜接近养殖区，严防禽霍乱病原菌的传入；对于那些禽霍乱常发地区，应定期进行禽霍乱弱毒苗的预防接种；对发病的养殖群，应及时采取隔离、封锁、治疗；定期观察鸡群情况，也可以适当添加适宜的抗生素进行预防。

[1] 马学恩.家畜病理学.第四版[M].北京：中国农业出版社，2007：285-286.

[2] 陆承平.兽医微生物学.第四版[M].北京：中国农业出版社，2007：134-137.