加工方式对羊乳表皮生长因子(EGF)浓度的影响

雷飞艳，云丹，王毕妮，邵玉宇，张富新

(陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安，710119)

加工方式对羊乳表皮生长因子(EGF)浓度的影响

雷飞艳，云丹，王毕妮，邵玉宇，张富新*

(陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安，710119)

研究加工方式对羊乳中表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)浓度的影响。其中主要通过均质、杀菌条件、搅拌、乳酸菌发酵以及贮存条件对乳中EGF浓度的影响。研究结果表明，均质过程对羊乳中EGF浓度几乎无影响(P>0.05)；随着搅拌时间的逐渐延长，低速时使EGF浓度先增加后减少，高速时使EGF浓度渐渐减少；羊乳在高温短时巴氏杀菌(75 ℃/15 s，85 ℃/10 s)时其中的EGF浓度较为稳定，保留率达到90 %以上，而在低温长时巴氏杀菌(63 ℃/30 min)和超高温瞬时杀菌(137 ℃/2 s)EGF浓度显著降低；随着发酵时间的延长，乳中EGF浓度逐渐降低，在冷藏过程中EGF浓度无显著性变化；随着贮存时间的逐渐延长，EGF在强化生鲜羊乳和全脂羊奶粉中都具有良好的稳定性。

羊乳；酶联免疫；表皮生长因子；加工方式

羊乳被誉为“乳中之王”，其中富含有蛋白质、矿物质、维生素、脂肪、胆固醇和多种生物活性物质[1-2]。羊乳营养价值高，具有润心肺、利大肠、补肾益精、滋阴养胃、治消渴、食疗的功能，在西方国家被作为疗效食品[3]。除此之外，羊乳中还有一定量的EGF，EGF对于后代的生长发育具有重要的作用，EGF不仅可以刺激多种细胞的增殖，主要是表皮细胞、内皮细胞，可用于眼角膜的损伤、烧烫伤及手术等创面的修复和愈合，而且对于美容养颜具有很大的功效。目前，有关乳中的EGF研究报道很少，尤其是羊乳中更是研究甚少。因此，本文较为系统地研究加工方式均质、搅拌、杀菌条件、发酵及贮存对于羊乳中EGF浓度的影响。以便为在加工方式中保护羊乳中EGF奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

羊乳，来自于陕西省杨凌和富平县奶山羊羊场；试剂盒(山羊表皮生长因子酶联免疫试剂盒)，来自美国R&D公司；EGF标准品，美国R&D 公司。

1.2 主要仪器

MDF-U5411型低温冰箱，日本三洋电机有限公司；智能生化培养箱，宁波海曙赛福实验仪器有限厂；TGL-16B型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；Multiskan Go型全波长酶标仪，美国热电公司；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；JJ-006/60均质机，廊坊通用机械有限公司；XMTD型数显恒温水浴锅，上海福玛实验设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 均质对EGF浓度的影响

取200 mL奶样，在室温条件下，均质压力分别为0、10、20、30、40、50 MPa，均质10 min后测定均质前后羊奶中EGF浓度变化。

1.3.2 搅拌对EGF浓度的影响

量取50 mL乳样于100 mL的烧杯中，在室温环境下，分别在低速800 r/min和高速3 500 r/min两个不同转速下搅拌5、10、15、20 min，以未搅拌处理乳样作为空白对照，测定其EGF含量。

1.3.3 杀菌方式对EGF浓度的影响

将乳样分别加到毛细管中，加热将毛细管两端封口，放到油浴中后分别在63 ℃/30 min(巴氏长时杀菌)、75 ℃/15 s(巴氏短时杀菌)、85 ℃/10 s(巴氏短时杀菌)、137 ℃/2 s(超高温瞬时杀菌)加热后，立即取出毛细管并置于冷水浴中冷却，以未杀菌处理乳样作为空白对照，测定其EGF含量。

1.3.4 发酵对EGF浓度的影响

(1) 粗提物EGF的制备：将乳样在6 000 g、4 ℃离心8 min，倒掉上层乳脂肪和下层酪蛋白沉淀，收集中层乳清，置于玻璃平板上，用报纸封口，并放在-40 ℃冰箱中冷冻12 h，然后进行冷冻干燥24 h，得到粗提物。

(2) 发酵剂的活化：将24 g的脱脂羊奶粉置于176 mL的水中，制成12%的羊乳脱脂复原乳，然后在121 ℃灭菌20 min，迅速冷却至43 ℃，然后加2%的发酵剂，混匀后在置于43 ℃培养箱4 h，得活化的发酵剂。

(3) 羊乳的发酵：将EGF的粗取物按照10%比例添加至鲜羊乳中，然后在80 ℃条件下灭菌20 min，冷却至43 ℃，再按照体积分数2%的比例添加已活化了的发酵剂，置于43 ℃培养箱中发酵至凝固状态，然后在5 ℃条件下贮存24 h进行后发酵，最后置于4 ℃的冰箱中保存。分别测定原料乳、发酵后，后发酵4、8、12、16、20 d时EGF浓度，然后计算出EGF的活性保留率。

1.3.5 贮存对EGF浓度的影响

(1)将粗提取的EGF加至灭菌的羊乳中(质量分数为10%)，混匀得到EGF强化羊乳，4 ℃条件下贮存12 d，然后分别在第0、4、8、12 d测定乳中EGF浓度。

(2)将粗提取的EGF加至全脂羊奶粉中(质量分数为10%)，混匀得到EGF强化全脂羊奶粉，25 ℃条件下贮存4周，然后分别在第1、2、3、4周测定其中EGF浓度。

1.3.6 EGF浓度的测定

(1)样品处理

按照OSLISLO[3]的方法处理并稍加改进。乳样解冻后，吸取0.5 mL羊乳置于2 mL离心管中，接着在3 000 g下离心15 min，去除上层脂肪和下层沉淀，取中间乳清部分，用ELISA试剂盒测定EGF浓度。

(2)EGF浓度的检测

EGF浓度采用酶联免疫(ELISA)试剂盒测定。将EGF试剂盒在室温(20 ℃)平衡20 min，取出其中的板条。取10 μL处理后的样品加入板条反应孔中，接着加样品稀释液40 μL，随后加辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体50 μL，用封板膜封住反应孔后，在37 ℃保温60 min。弃去反应孔中液体，在滤纸上拍干，加入预先稀释好的洗涤液350 μL，放置1 min，弃去洗涤液，拍干，如此操作重复5次。在洗涤后的反应孔中加入A、B底物各50 μL，37 ℃保温15 min后在反应孔中加入终止液50 μL，15 min内在波长450 nm处测定各孔的吸光度值。每个样品做3次平行。

(3)标准曲线绘制

用酶联免疫试剂盒方法检测不同浓度EGF标准品的吸光度，然后以标准品浓度为横坐标(X)，对应吸光度值为纵坐标(Y)，绘制EGF标准曲线。计算线性回归方程，按回归方程计算各样品EGF浓度。计算线性回归方程，按照线性回归方程计算不同样品中的EGF浓度。线性回归方程为y=0.001 87x+0.081 8，R2=0.999 13。

(4) 数据分析

试验数据采用DPS统计分析软件处理，Duncan新复极差法进行显著性检验。

2 结果及分析

2.1 均质对EGF浓度的影响

取200 mL奶样，在室温条件下，均质压力分别为0、10、20、30、40、50 MPa，均质10 min后测定均质前后羊奶中EGF浓度变化。结果见图1和表1。

图1 均质压力对羊乳巾EGF浓的影响Fig.1 Effects of homogenaging pressure on the concentrations of EGF in goat milk

从图1和表1可以看出，均质前， EGF的浓度为(50.73±1.01)ng/mL，在均质压力为0、10、20、30、40、50 MPa均质时的保留率分别为91.19%、94.74%、92.80%、95.58%、97.90%，其保留率均在90%以上，因此均质压力对EGF的浓度无显著性影响(P>0.05)，说明羊乳中的EGF对均质压力具有较高的稳定性。

在乳制品加工中均质是很常用的一种处理方式，它可使乳中脂肪粒变小，从而提高乳的稳定性。一方面，均质可以使乳脂肪球膜上的EGF脱离，从而使EGF浓度升高，同时影响着蛋白质的分子结构，破坏了维持蛋白质的非共价键和疏水作用，从而使得蛋白质发生变性。另一方面，EGF是蛋白质，主要由非共价键维持着其活性中心，这种非共价键在压力条件下表现的比较敏感，均质过程中使得其中的离子键和疏水作用被破坏，从而使得蛋白质分子内及分子间产生更多的氢键，使蛋白质球状结构内部氨基酸侧链外露[4]，使活性中心结构发生改变，从而使得EGF的活性降低[5]。此外，在均质压力下，乳的流速逐渐增大，并且伴随着撞击、空穴等作用，使得EGF的构象和活性中心发生改变，从而使其中的生物活性失去或钝化；加上均质过程中由于较高的流体速度引起的摩擦使乳温度上升[6]，这些都会引起EGF变性，从而使EGF活性降低。

表1 均质压力对羊乳EGF浓的影响

2.2 搅拌对EGF浓度的影响

取50 mL奶样于100 mL的烧杯中，在室温条件下，分别在低速800 r/min和高速3 500 r/min两个不同转速下搅拌5、10、15、20 min，测定其EGF浓度。结果见图2。

图2 搅拌对羊乳中EGF浓度的影响Fig.2 Effect of agitation on the concentrations of EGF in goat mild

由图2可以看出，搅拌对EGF浓度有所影响。在较低速度800 r/min下搅拌时，随着搅拌时间的逐渐延长，EGF的浓度呈现的趋势是先增加后减少。尤其是在5 min时，EGF浓度达到最大，由刚开始的(50.73±1.01) ng/mL上升到(55.63±1.05) ng/mL，与原料乳样的EGF浓度相比有显著性差异(P<0.05)；从5 min以后，随搅拌时间的延长，羊乳中EGF浓度呈现逐渐降低趋势。在较高速度3 500 r/min下搅拌时，随着搅拌时间的延长，EGF浓度呈现的趋势是逐渐减小。从图中可以看出，高速搅拌比低速搅拌时EGF浓度下降速度更快，因此可以说明，高速搅拌比低速搅拌对乳中EGF浓度影响更大。

乳腺细胞合成并且分泌EGF的主要途径是通过合成为乳脂肪膜结合性的EGF，且低速短时地进行搅拌会使乳中EGF活性被激活，由于搅拌可能会影响脂肪球膜和EGF的物理状态，在搅拌速度很低的情况下，脂肪球膜与EGF会发生分离，从而使更多的EGF被释放出来。但是如果进行长时间的搅拌或者过快搅拌时，这样会导致乳温升高[7]，从而EGF的结构会被破坏[8]，李建华[9]通过研究护肤品配方对EGF的影响，结果表明温度升高会使EGF的的活性降低。

2.3 杀菌方式对EGF浓度的影响

将预处理后的奶样加入毛细管中，在酒精灯上加热并将两端封口，置于油浴中分别在63℃/30 min(巴氏长时杀菌)、75℃/15 s(巴氏短时杀菌)、85℃/10 s(巴氏短时杀菌)、137℃/2 s(超高温瞬时杀菌)加热后，取出毛细管并立即置于冰浴中冷却，测定EGF浓度并计算其活性保留率。结果见图3和表2。

图3 杀菌条件对羊乳中EGF浓度的影响Fig.3 Effect of sterilintion condition on the concentrations of EGF in goat milk

表2 杀菌条件对羊乳中EGF浓度的影响

由图3和表2可以看出，杀菌条件对EGF浓度有所影响。从中可以看出，EGF的保留率均在90%以上，表明巴氏短时杀菌对EGF浓度无显著性影响(P>0.05)；在巴氏长时杀菌和超高温短时杀菌时， EGF保留率显著低于巴氏短时杀菌(P<0.05)。由此可以说明巴氏短时杀菌可以更大限度保留乳中的EGF，而巴氏长时杀菌和高温短时杀菌可能会引起EGF结构发生相应的改变，从而使EGF部分失活。

YAGI[10]等对鲜牛乳进行巴氏杀菌后检测出其中的EGF损失率达到了50%左右；关荣发[11]等对乳进行热处理研究其对EGF的影响，发现原料乳中的EGF浓度达到最高，其次是巴氏杀菌乳、(超高温瞬时灭菌)UHT乳、国外婴幼儿配方奶粉，由此可以说明热处理对乳中EGF浓度有一定的影响。

2.4 发酵对EGF浓度的影响

通过由羊乳制备的酸羊奶，分别测定羊乳发酵前、发酵后，后发酵4、8、12、16、20 d时乳中EGF浓度变化，然后计算出乳中EGF的保留率。结果见图4。

图4 发酵对羊乳中EGF浓度的影响Fig.4 Effect of fermentation on the concentrations of EGF in goat mild

从图4可以看出，发酵对EGF活性影响比较大。随着发酵时间的延长，EGF的浓度和保留率下降趋势比较大。发酵后乳中的EGF的保留率是64.80%，减少了接近35%；从刚开始发酵到冷藏8 d这段时间内，EGF的保留率达到显著性降低(P<0.05)，从冷藏第8 d到冷藏第20 d的这段时间，羊乳中EGF浓度表现出无显著性差异(P>0.05)，尤其是冷藏第20 d时EGF的保留率为34.80%，减少了接近65%。因此可以总结出，发酵期间和冷藏初期时EGF浓度下降比较快，但在冷藏4 d后乳中EGF的浓度是比较稳定的。

羊乳在发酵过程中pH值会有相应的改变，一方面，EGF可以作为乳酸菌生长繁殖所需的营养成分氮源而被利用，使得乳酸菌能够继续生长，另一方面，可能是由于乳酸菌生长代谢过程中产生的某些代谢产物(如蛋白酶)可以导致EGF发生分解，因此发酵乳中EGF含量会相应的降低[12-13]。

2.5 贮存条件对EGF浓度的影响

用粗提取的EGF分别制备强化生鲜羊乳和强化全脂羊奶粉，测定其在贮存期间EGF浓度变化，结果见图5和图6。

图5 EGF强化鲜羊乳的贮藏稳定性Fig.5 The stability of EGF enhanced raw goat milk during storage(注：贮存条件为4℃)

图6 EGF强化全脂羊奶粉的贮存稳定性Fig.6 The stability of EGF enhanced whole goats' milk powder during storage(注：贮存条件为25℃)

由图5和图6可以看出，随着贮存时间的延长，EGF强化生鲜羊乳和强化全脂羊奶粉都比较稳定。KANG[14]等在研究IGF-1强化生鲜牛乳和强化全脂牛奶粉的贮存稳定性时，发现IGF-1在整个贮存期间都具有较好的稳定性，显然，EGF和IGF-1都是小分子多肽，在贮存期间其结构基本不会发生改变，具有很好的稳定性。

3 结论

研究加工方式对羊乳中表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)浓度的影响。其中主要通过均质、杀菌条件、搅拌、发酵和贮存条件对乳中EGF浓度的影响。研究结果表明，均质过程对羊乳中EGF浓度几乎无影响(P>0.05)；随着搅拌时间的延长，低速时使EGF浓度先增加后减少，高速时使EGF浓度渐渐减少；羊乳在高温短时巴氏杀菌(75 ℃/15 s，85 ℃/10 s)时其中的EGF浓度较为稳定，保留率达到90 %以上，而在低温长时巴氏杀菌(63 ℃/30 min)和超高温瞬时杀菌(137 ℃/2 s)EGF浓度显著降低；随着发酵时间的延长，乳中EGF浓度逐渐降低，在冷藏过程中EGF浓度无显著性变化；随着贮存时间的逐渐延长，EGF在强化鲜羊乳和全脂羊奶粉中都具有良好的稳定性。

[1] 刘洪波, 施兆红. 山羊奶——现代人类健康的营养佳品[J]. 中国畜牧杂志, 2005, 41(11): 52-53.

[2] 李莹, 周剑忠, 努尔古丽. 热合曼, 等. 山羊酸奶加工工艺研究[J]. 乳业科学与技术, 2008, 31(3): 104-106.

[3] 陈伟,蒋明, 沈涛, 等 羊奶的营养价值及我国羊奶产业发展存在的问题[J]. 中国乳业, 2009(12):46-47.

[4] 蒋明. 用生物信息学方法研究金属离子在蛋白质折叠中的作用[D]. 武汉：华中科技大学, 2003.

[5] 王苑, 朱学伸, 周光宏,等. 高压处理对肌原纤维和大豆分离蛋白混合凝胶特性的影响[J]. 江西农业学报, 2007, 19(5):105-108.

[6] PEREDA, 兰心怡(摘译), 卜登攀(校). 超高压力均质牛奶中的热损害评价[J]. 中国畜牧兽医, 2009(10):170-170.

[7] MIZUSHIMA Y, TAKAGI Y, HIGAKI M, et al. Fine Inorganic particles having drug included therein. Method for prepartion thereof and pharmaceutical preparation comprising fine inorganic particles having drug included therein: US, EP1398025[P]. 2004.

[8] 石占霞. Notch受体的配体Delta-like1蛋白表达、纯化及其性能研究[D]. 西安：西北大学, 2008.

[9] 李建华. 护肤品配方中各因素对EGF生物活性的影响[J]. 日用化学品科学, 2011, 34(11):26-29.

[10] YAGI H, SUZUKI S, NOJI T, et al. Epidermal growth factor in cow's milk and milk formulas[J].Acta Paediatrica, 1986, 75(2): 233-235.

[11] 关荣发, 叶兴乾, 徐贵华, 等. 乳品加工中热处理对胰岛素样生长因子-1和表皮生长因子的影响[C]. 第二届中国浙江学术节—食品安全监管与法制建设国际研讨会暨第二届中国食品研究生论坛, 2005：449-451.

[12] JAEGER K E,RANSAC S, DIJKSTRA B W, et al.Bacterial lipases[J]. FEMS. Microbiology Reviews, 1994, 15(1): 29-63.

[13] 柯世省. 工程菌LacUV5par8egf产hEGF发酵方法的比较[J]. 中国现代应用药学, 2001, 18(3):209-212.

[14] 姚学勤. 甘油去阻遏表型巴斯德毕赤酵母(PichiaPastoris)的构建及其初步研究[D]. 北京：中国人民解放军军事医学科学院, 2009.

The effect of processing methods on the concentrations of EGF in goats'milk

LEI Fei-yan, YUN Dan, WANG Bi-ni, SHAO Yu-yu, ZHANG Fu-xin*

(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119, China)

The effect of processing methods on goat milk EGF concentration, including homogeneous ,stirring, sterilization, fermentation by lactic acid bacteria and storage conditions was studied. The results showed that homogeneous had no effect on goat milk EGF concentration; EGF concentrations increased and then decreased by low-speed string, if stirring at high speed, goat milk EGF concentration decreased gradually. High-temperature short-time pasteurization (75℃/15 s and 85℃/10 s) had little effect on EGF concentration in goat milk, retention rate reached more than 90%; but low-temperature, long-time pasteurization (63℃/30 min) and ultra-high temperature sterilization (137℃/2 s) significantly reduced goat milk EGF concentration. Fermentation process influenced goat milk EGF concentrations and caused its decreased rapidly with the fermentation time. EGF concentration had little change during refrigerated storage and are very stable in EGF enhance goat milk and EGF enhance whole goat milk powder.

goat milk; enzyme linked immunosorhent assay(ELISA); epidermal growth factor; processing methods

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703033

硕士研究生(张富新教授为通讯作者,E-mail: fuxinzh@snnu.edu.cn)。

陕西省重大科技成果转化引导专项(2016KTCG01-12)；中央高校基本科研业务费专项资金资助(GK201603097)；陕西省农业科技创新与攻关项目(2016NY-207)；陕西省农业科技攻关项目(2012K02-06)

2016-07-13，改回日期：2016-08-26