四川泡菜中产γ-氨基丁酸植物乳杆菌BC114发酵条件优化

曾林，谭霄，张庆*，杨颖，唐洁

1(西华大学 食品与生物工程学院，四川省食品生物技术重点实验室，四川 成都，610039) 2(西华大学 古法发酵(酿造)生物技术研究所，四川 成都，610039)3(山东省食品药品检验研究院，山东 济南，250101)

四川泡菜中产γ-氨基丁酸植物乳杆菌BC114发酵条件优化

曾林1,2，谭霄1，张庆1,2*，杨颖3，唐洁1

1(西华大学 食品与生物工程学院，四川省食品生物技术重点实验室，四川 成都，610039) 2(西华大学 古法发酵(酿造)生物技术研究所，四川 成都，610039)3(山东省食品药品检验研究院，山东 济南，250101)

为拓展产γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)微生物资源，以四川泡菜为分离源，从中分离具有产GABA能力的乳酸菌，并对其进行发酵条件优化。通过高效液相色谱法对筛选到的GABA菌株进行表达能力评估发现，菌株BC114在含10 g/L L-谷氨酸钠的MRS培养基于37 ℃发酵48 h后，发酵液中GABA质量浓度为1.72 g/L。以MRS培养基为基础培养基，采用单因素试验和响应面中心组合试验设计对发酵条件进行优化，得到最适培养基组成为葡萄糖15 g/L、牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、柠檬酸三铵2 g/L、K2HPO41.50 g/L、L-谷氨酸钠17 g/L、乙酸钠5 g/L、MnSO40.05 g/L、MgSO40.10 g/L、吐温-80 1 mL/L；培养条件为pH 5.50、发酵温度37 ℃、发酵时间80 h、接种量4%。在此优化条件下，植物乳杆菌BC114产GABA能力达到3.82 g/L，较优化前提高了2.22倍。

植物乳杆菌BC114；γ-氨基丁酸；响应面分析法

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)是通过谷氨酸脱羧酶(GAD)生物合成的非蛋白质氨基酸[1]。在哺乳动物中，GABA以一种重要的抑制性神经递质存在于中枢神经系统中[2]，具有降低血压、利尿、增强记忆等多种生理功能[3-5]。GABA既是一种具有显著药理作用的药物[6]，又被视为具有保健功能的新型功能性因子，在食品、医药等领域具有十分乐观的应用前景[7]。因此，GABA的合成引起了人们的广泛关注和重视。

GABA在动植物体内分布广泛，但其天然含量低，从天然组织中分离提取难度大[8]，目前获得GABA的方法主要有化学合成、植物富集法和微生物发酵法三大类[9]。相比而言，化学合成GABA法反应条件复杂、污染大；植物富集法产GABA难度大、含量低；而微生物发酵法产GABA条件温和、安全性好，成为了目前GABA生产的理想方法[10]。近年来，含有谷氨酸脱羧酶的霉菌[11]、酵母[12]和乳酸菌[13]等作为发酵剂用于微生物发酵生产GABA，Anussara Ratanaburee[14]等利用LactobacillusnamurensisNH2和PediococcuspentosaceusHN8作发酵剂生产富含GABA发酵猪肉香肠；Ja Young Kim[15]等利用LactobacillusbrevisGABA100发酵生产GABA黑莓果汁。然而，优良菌株的缺乏制约了GABA发酵法的进一步发展，Naser Tajabadi[16]等从蜂蜜中分离产GABA的LactobacillusplantarumTaj-Apis362, 响应面优化后GABA质量浓度仅0.721 g/L; 黄桂东[17]等从黄酒发酵液中分离出的LactobacillusplantarumMJ0301进行培养基优化后GABA质量浓度仅1.59 g/L。因此，如何获取优良菌株成为了开发GABA微生物发酵法的重要任务。

本研究以四川泡菜为原料，分离、筛选出高产GABA的乳酸菌菌株，以MRS培养基为基础培养基，采用响应面优化设计试验对影响GABA产量的各因子及其交互作用进行优化，确定筛选菌株的最佳发酵条件，旨在为高产GABA菌株的开发、应用以及产GABA发酵条件优化等相关研究及后续研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 菌种

四川泡菜中分离出的12 株具有产GABA能力的乳酸菌菌株，NCBI登录号为KU761831～KU761842，西华大学食品与生物工程学院保藏。

1.2 培养基和培养条件

MRS液体培养基：葡萄糖20 g/L，牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，柠檬酸三铵2 g/L，K2HPO42 g/L，乙酸钠5 g/L，MnSO40.05 g/L，MgSO40.10 g/L，吐温-80 1 mL/L，调节pH6.20，121 ℃条件下灭菌20 min。发酵培养基：在MRS液体培养基的基础上添加10 g/L L-谷氨酸钠。

取经活化培养16 h的种子液(约108CFU/mL)，以4%的接种量接种于100 mL发酵培养基的250 mL的三角瓶中，30 ℃静止培养48 h。

1.3 GABA表达能力评估

采用HPLC定量分析对各菌株产GABA能力进行评估。参照张术聪[18]等柱前衍生的方法对发酵液中GABA进行柱前衍生。HPLC分析条件：色谱柱为岛津-GL INERTSIL ODS-3(4.6 mm×150 mm，5 um)；紫外检测波长254 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL；流动相A为甲醇，流动相B为醋酸钠(pH 6.20)∶甲醇∶四氢呋喃(420∶75∶5，V/V/V)；流速1 mL/min；梯度洗脱时，流动相B比例为：0～6 min，80%～50%；6～9 min，50%～20%；9～10 min，20%～0%；10～11 min，维持0%；11～15 min，返回80%。

1.4 筛选菌株生理生化特征和16S rRNA测序分析

根据《伯杰氏系统细菌学手册》[19]和《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》[20]中试验方法进行常规的生化测试，同时采用16S rRNA测序分析，所得序列提交至NCBI进行Blast比对。

1.5 单因素试验

根据查阅文献及前期实验筛选[21-22]，以MRS培养基为基础培养基，按4%的接种量，选取影响菌株GABA产量和生长情况(A600nm)的因素：L-谷氨酸钠质量浓度(0～20 g/L)，初始pH(5～7)，发酵温度(30～38 ℃)和发酵时间(24～84 h)进行单因素试验。

1.6 响应面优化设计试验

采用响应面分析方法对筛选菌株产GABA发酵条件进行优化，根据CCD的中心组合设计原理[17]，以L-谷氨酸钠质量浓度、初始pH、发酵温度和发酵时间4个因子为自变量，以GABA产量为响应值，设计了四因素三水平的响应面分析试验，并用Design-Expert7.0软件对实验数据进行回归分析。

2 结果与分析

2.1 GABA表达能力评估分析

利用HPLC定量分析对菌株产GABA能力进行评估。其标准曲线为Y=9E+06X-18007(R2=0.999 2)。因此，可用于菌株发酵液中的GABA进行定量分析，定量结果如图1所示，12 株菌株发酵液中γ-氨基丁酸质量浓度为0.28～1.72 g/L，其中菌株BC114发酵产γ-氨基丁酸质量浓度较高，达1.72 g/L。周青[23]等从泡菜中筛选到一株植物乳杆菌，发酵液中GABA质量浓度达1.26 g/L，并通过正交试验优化发酵条件及其培养基成分，发酵液中GABA产量提高了79%。因此，菌株BC114发酵生产GABA更具有优势，下一步可对其进行发酵条件及其培养基成分的优化。

图1 四川泡菜中筛选的12株乳酸菌产GABA能力的大小(不同字母表示数据差异显著，P<0.05)Fig.1 Comparison of GABA production by 12 LAB strains isolated from Sichuan Pickle

2.2 菌株BC114生理生化特征及16S rRNA测序分析

通过常规的生理生化特征分析，菌株BC114为革兰氏阳性菌，在15～45 ℃培养条件下，能在厌氧和有氧条件下生长良好，结果见表1，同化碳源试验表明，纤维二糖、果糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蜜二糖、棉籽糖、核糖、山梨糖、蔗糖和海藻糖为阳性；阿拉伯糖、松三糖、鼠李糖和D-木糖为阴性。16S rRNA基因测序分析菌株BC114(KU761835)与LactobacillusplantarumJCM 1149 (NR_115605.1)相似度为100%，因此，结合生理生化特征，菌株BC114被鉴定为L.plantarum。

2.3L-谷氨酸钠质量浓度、初始pH、发酵温度和时间对L.plantarumBC114生长及GABA产量的影响

L-谷氨酸钠质量浓度增大可使GABA支路中碳流量增加，并调节GAD活性。L-谷氨酸钠质量浓度对菌株BC114生长及GABA产量的影响如图2-a所示，L-谷氨酸钠质量浓度对菌株BC114产GABA有较大的影响，而菌体浓度基本保持不变。随着L-谷氨酸钠质量浓度的增大，GABA的产量也随之增加，当L-谷氨酸钠质量浓度超过15 g/L后，GABA产量缓慢减少。因此选择15 g/L为L-谷氨酸钠的最优质量浓度。

表1 菌株BC114主要的生理生化测试

培养基pH值可通过影响生物体内的酶反应、细胞膜对营养物质的运输等方式来影响菌体的生长及代谢产物的积累。试验将培养基的初始pH分别调节为pH5.00～7.00，探讨培养基的初始pH对L.plantarumBC114的生长及GABA产量的影响。结果表明，菌体浓度在初始pH6.00时最高，随着pH升高菌体浓度缓慢降低，GABA质量浓度在初始pH 5.50时最高，随pH升高GABA产量迅速降低(如图2-b)。刘佳荣[24]等筛选获得的L.plantarumLp-Dfa301在pH 5.00时产GABA能力最强，Naser Tajabadi[25]等筛选获得的L.plantarumTaj-Apis362在pH 5.50时产GABA能力最强。综上所述，试验选择pH 5.50是合理的，可供后续研究。

发酵温度对L.plantarumBC114的生长及GABA产量的影响结果如图2-c所示，随着发酵温度的提高，GABA的产量逐渐增加，36 ℃时达到最高值，随着温度的继续升高，GABA产量降低。由于高温或低温条件下都会影响菌体GABA代谢关键酶的活性、稳定性、与底物的结合程度等，进而影响菌体的生长与代谢；Naser Tajabadi[16]等研究表明L.plantarumTaj-Apis362合成GABA关键酶(GAD)在36 ℃时活性最高，故选取发酵温度36 ℃。

图2 L-谷氨酸钠，初始pH，发酵温度和发酵时间对菌株BC114生长及GABA产量的影响Fig.2 Effects of sodium L-glutamate concentration, initial pH, temperature and fermentation time on the growth of L .plantarum BC114 and the yield of GABA

发酵时间对L.plantarumBC114生长及GABA产量的影响如图2-d所示，在发酵24 h后，随着时间延长，菌体浓度缓慢减少，发酵60 h后菌体浓度基本保持不变，同时随着发酵时间增加，发酵液中GABA产量也随之增加，在发酵72 h达到最大，因此选择72 h为最优发酵时间。

2.4 响应面试验结果

基于文献和单因素试验结果[26-27]，选取L-谷氨酸钠、初始pH、发酵温度和发酵时间度作为响应面分析的有效变量。以L-谷氨酸钠质量浓度15 g/L、培养温度36 ℃，初始pH 5.50和发酵时间72 h为响应面分析中心点(如表2)，进行四因素三水平的响应面试验。

表2 响应面试验设计方案与响应值

对表2试验数据进行多项拟合回归，以GABA产量为因变量，L-谷氨酸钠质量浓度、初始pH、发酵温度和发酵时间为自变量建立回归方程：

Y=3.77+0.031A+0.14B-0.012C+0.24D-0.089AB-0.011AC+0.068AD-0.015BC+0.031BD-0.026CD-0.21A2-0.24B2-0.36C2-0.21D2

依据回归方程，利用Design-Expert 7.0软件绘制响应曲面图(图3)。对模型方程求导得到最大预测值GABA产量为3.87 g/L，此时对应变量的最佳值：发酵温度为37.11 ℃、L-谷氨酸钠质量浓度为16.59 g/L、初始pH5.48和发酵时间为79.47 h。

表3 响应面设计的回归方程系数显著性检验及方差分析

注：*. 差异显著(P<0.05)；**.差异极显著(P<0.01)。

图3 各因素交互影响的响应面法立体分析图Fig.3 Response surface plots showing the interaction effect of factors on the yield of GABA

2.5 响应面模型的验证和优化

为了验证预测值的真实性，按照响应面分析法得到的优化组合，并根据实际应用情况，以葡萄糖15 g/L、牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、柠檬酸三铵2 g/L、K2HPO41.50 g/L、L-谷氨酸钠17 g/L、乙酸钠5 g/L、MnSO40.05 g/L、MgSO40.10 g/L、吐温-80 1 mL/L、pH 5.50、发酵温度37 ℃、发酵时间80 h、接种量4%进行发酵，GABA的产量为3.82 g/L，该实验值与模型的预测值3.87 g/L接近，从而验证了预测值的准确性，说明优化模型可靠。同时，与优化前(初始培养基及培养条件：1.72 g/L)相比，GABA的产量提高了2.22倍，表明优化方案设计合理有效，所获的优化培养基及发酵条件能够明显提高L.plantarumBC114产GABA的产量。

3 结论

本研究对四川泡菜中分离得到12 株具有产GABA能力的乳酸菌菌株进行能力评估，筛选出菌株L.plantarumBC114产GABA的产量最高，在含10 g/LL-谷氨酸钠的MRS培养基发酵48 h后，发酵液中GABA质量浓度为1.72 g/L。以MRS为基础培养基，GABA产量为响应值，根据单因素试验结果，采用响应面法对L.plantarumBC114产GABA发酵条件进行优化，得出最适培养基成分为葡萄糖15 g/L、牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、柠檬酸三铵2 g/L、K2HPO41.50 g/L、L-谷氨酸钠17 g/L、乙酸钠5 g/L、MnSO40.05 g/L、MgSO40.10 g/L、吐温-80 1 mL/L；培养条件为pH 5.50、发酵温度37 ℃、发酵时间80 h、接种量4%。在此优化条件下，植物乳杆菌BC114产GABA能力达到3.82 g/L，较优化前提高了2.22倍。

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Optimization of γ-aminobutyric acid production byLactobacillusplantarumBC114 from Sichuan pickle

ZENG Lin1,2, TAN Xiao1, ZHANG Qing1,2*, YANG Ying, TANG Jie1

1(Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan, College of Food and Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China) 2(Biotechnology Institute of Ancient Brewing, Xihua University, Chengdu 610039, China) 3(Food and Drug Institute of Shandong, Shandong, Jinan 250101, China)

The aim of the present study was to optimize the fermentation conditions of γ-aminobutyric acid (GABA)-producing by lactic acid bacteria from Sichuan Pickle. The performance of GABA- producing strains was evaluated by high performance liquid chromatography (HPLC) method. The results showed that strain BC114 had the higher GABA-producing ability (1.72 g/L) in MRS broth with 10 g/L initial glutamic acid after fermented at 37 ℃ for 48 h. On the basis of MRS culture medium, fermentation conditions ofLactobacillusplantarumBC114 for GABA were optimized by response surface central composite design (CCD). The results showed that the optimal fermentation medium was comprised of glucose 15 g/L, beef extract 10 g/L, peptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, trisodium amine 2 g/L, dipotassium phosphate 1.50 g/L, L- glutamate 17 g/L, sodium acetate 5 g/L, manganese sulfate 0.05 g/L, magnesium sulfate 0.10 g/L, and Twain-80 1 mL/L. And the optimal fermentation condition was as follows: pH 5.50, fermentation temperature 37 ℃, fermentation time 80 h and inoculum amount 4%. Under the optimized conditions, the production of GABA by L. plantarum BC114 reached 3.82 g/L, which was 2.22-fold higher than that before the optimization.

LactobacillusplantarumBC114; γ-aminobutyric acid; response surface methodology

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703021

硕士研究生(张庆副教授为通讯作者,E-mail：biozhangq@163.com)。

四川省应用基础项目(2016JY0253)；教育部春晖计划项目(Z2014060)；四川省食品生物技术重点实验室项目(szjj2016-019)

2016-09-13，改回日期：2016-12-05