1株Lodderomyceselongisporus酵母对浓香型白酒发酵的影响

游玲，李美华，王陟垚，梅伶俐，孙雪琴，余丽辰，王涛*

1(宜宾学院 生命科学与食品工程学院，四川 宜宾，644000) 2(宜宾学院，固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川 宜宾，644000)

1株Lodderomyceselongisporus酵母对浓香型白酒发酵的影响

游玲1,2，李美华1，王陟垚1，梅伶俐1，孙雪琴1，余丽辰1，王涛1,2*

1(宜宾学院 生命科学与食品工程学院，四川 宜宾，644000) 2(宜宾学院，固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川 宜宾，644000)

为探究1株Lodderomyceselongisporus酵母对浓香型白酒发酵的影响，通过强化接种该酵母到固态发酵糟醅中发酵50 d，分析糟醅的理化指标、风味物质含量以及微生物区系的变化。结果显示，该酵母可使糟醅中还原糖含量显著增加，氨基态氮显著减少，乙缩醛、己酸生成量显著增加；且该酵母菌株大幅降低糟醅中真菌群体丰富度和多样性，强化接种的L.elongisporus取代原有优势真菌Zygosaccharomyces成为新的优势真菌，同时该酵母对细菌群体多样性影响相对较小，优势细菌Lactobacillus属丰度增加，Pseudomonas属丰度减少。结果表明,强化接种L.elongisporus酵母菌将改变浓香型白酒风味，且可对续糟发酵产生不可预知的持续影响。

Lodderomyceselongisporus；浓香型白酒；强化接种；影响；微生物区系

白酒酿造是原料、微生物细胞及其代谢产物相互作用的结果，酵母菌是主要的产酒功能菌，同时在香气物质形成方面也起着重要作用[1]，如产酯酵母有助于形成浓香型白酒的特征风味[2]。已有研究表明，不同香型白酒的酿造酵母区系有着明显差异[3]，但多数报道主要集中在酵母，特别是酿酒酵母在纯培养条件下的产酒精、产酯能力研究[4-5]。近年来的研究表明，酵母与多种风味物质的生成关系密切[6]，不同酵母菌对白酒风味有不同的影响[7]，并且酵母菌与细菌、真菌之间还存在广泛的相互作用[8]。因此，在浓香型白酒酿造这种典型混菌发酵体系中，酵母群体不仅可通过自身代谢产物，也可通过与其他微生物的相互作用来影响浓香型白酒的产量及风味，但目前仍缺乏相应的实验证据。

Lodderomyces酵母作为一种发酵效率较低，但对风味有重要贡献的非酿酒酵母，虽不能分泌麦芽糖水解酶，不能发酵麦芽糖和麦芽三糖，但能发酵部分葡萄糖、果糖以及全部的蔗糖[9-10]，在啤酒酿造中，Lodderomyces酵母产生的酒精仅为啤酒酵母的1/6，且酸类物质、酯类物质及酯类和正丙醇生成量较少，对口感没有明显影响[11]。在白酒酿造中该属酵母的研究、应用均较少，而作为宜宾浓香型白酒中四大优势酵母之一[12]，L.elongisporus酵母很可能与浓香型白酒风味形成有关。

因此，本研究以浓香型白酒糟醅中分离到的1株可在YPD培养基中产酯的L.elongisporus酵母为研究对象，通过接种该菌株到混菌固态发酵糟醅中，检测其对浓香型白酒主要风味物质生成的影响，以及对酿造微生物生态的影响，来探究该酵母菌株在浓香型白酒发酵过程中的作用，并评估其可能的应用价值，为后续用于浓香型白酒生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

分离自浓香型白酒窖房的酵母菌株，编号Z8Y-91，鉴定为Lodderomyceselongisporus(现保存于四川省固态发酵资源利用四川省重点实验室)。

1.2 发酵试验

入窖糟醅取自四川宜宾某知名多粮浓香型白酒企业，黄水为取糟醅的窖池上一轮发酵黄水。

斜面菌种以YPD 培养基活化并扩培后，3 000 r/min离心5 min去掉上清液，加入无菌水调整浓度为108个/mL，4 ℃保存备用。

混菌处理：在浓香型白酒酿造车间，入窖粮糟中加入体积分数为1%的黄水混匀后，分装入1 L的玻璃坛，每坛(0.83±0.05) kg，每个玻璃坛接种50 mL菌悬液，充分混匀后，自内向外依次以丢糟、窖皮泥、保鲜膜、牛皮纸封口。

纯菌对照：添加黄水的糟醅装入玻璃坛后，1×105Pa灭菌30 min，冷却至35 ℃左右接种50 mL菌悬液，其余操作同混菌处理。

空白对照：除以等体积的无菌水代替50 mL菌悬液接种未灭菌的糟醅外，其余操作同混菌处理。处理和对照均设3个重复。

1.3 总DNA提取

采用Omega细菌及真菌基因组提取试剂盒(E.Z.N.A)提取混菌发酵及空白糟醅DNA，送至上海生物工程有限公司进行高通量测序。

1.4 风味物质以及乳酸检测

将固液态发酵样品加入200 mL的去离子水，蒸馏得到100 mL的蒸馏液，所有的蒸馏液均过滤备用。

采用FFAP色谱柱(50 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent USA)和LZP-930色谱柱(50 m×0.25 mm×0.25 μm，郑州普析)通过安捷伦气相色谱(Agilent 7890A)检测有机酸及其他主要风味物质[13]；采用C18柱(5 μm×250 mm×4.6 mm)通过安捷伦液相色谱(Agilent 1220)检测乳酸含量[14]。

1.5 理化指标检测

(1)淀粉含量：依据GB/T 5009.9—2008，采用酶水解法来测定淀粉含量[15]。

(2)还原糖含量：依据GB/T 5009.7—2008，采用斐林试剂滴定法来测定还原糖含量[15]。

(3)酸度：依据GB/T 9736—2008，采用滴定分析法来测定酸度[16]。

(4)氨基态氮：依据GB 12143.2，采用甲醛值法来测定氨基态氮含量[16]。

2 结果与分析

发酵50 d后，所有处理及对照均气味正常，表面无肉眼可见的杂菌污染，强化接种Z8Y-91菌株的混菌发酵糟醅保持了与对照一致的浓香风味，但其糟香较空白略淡，而纯菌发酵的风味与混菌发酵差别较大。以下分别讨论该酵母对糟醅中碳氮源转化、风味物质生成及微生物区系构成的影响。

2.1 Z8Y-91对糟醅中的碳氮源转化的影响

从图1可知，接种Z8Y-91的混菌发酵糟醅淀粉、还原糖、乙醇含量高于接种该菌株的纯菌发酵糟醅，可能是因为糟醅灭菌后，其中的微生物及酶活性被灭活，导致整个发酵体系中原有的糖化酶不再起作用，而外加的糖化酶糖化效果较差，导致由淀粉生成的还原糖量较少，因此产酒精也较少。混菌发酵糟醅中的氨基态氮略高于未添加蛋白酶的灭菌糟醅，也证实了高温对蛋白酶的灭活作用，但总体上灭菌与否对糟醅碳、氮源转化均没有显著影响。

图1 Z8Y-91对糟醅中的碳氮源转化的影响(乙醇的单位是mg/10L，淀粉、还原糖的单位是mg/100g，氨基态氮的单位是g/kg；a、b分别表示与空白对照、纯菌发酵糟醅的差异达到显著水平(P<0.05)，下同。) Fig.1 Influence on the degradation of carbon and nitrogen in fermentative grains caused by Z8Y-91(The unit of ethanol is mg/10L, mg/100g for the starch and reduced sugar, and g/kg for the amino nitrogen; a, b means P<0.05 compared with the control and the pure culture respectively, and the same below)

与空白相比，接种Z8Y-91菌株的混菌发酵糟醅中淀粉、还原糖含量较高，乙醇含量、氨基态氮较低，可能是因为强化接种Z8Y-91后虽然使发酵体系的淀粉转化率提高，还原糖显著增加，但是整个发酵体系的发酵力减弱，因此产酒精较少。混菌发酵醩醅中的氨基态氮显著低于空白对照，可能是因为接种Z8Y-91后蛋白酶活性降低，转化生成较少的氨基态氮。

2.2 Z8Y-91对糟醅中风味物质生成的影响

2.2.1 Z8Y-91对糟醅中的醛类物质生成的影响

从图2可知，接种Z8Y-91菌株的灭菌糟醅中乙缩醛含量极显著地高于混菌发酵糟醅，而混菌糟醅乙缩醛生成量又极显著地高于空白对照，表明该酵母菌株对乙缩醛的生成有重要影响，混菌发酵糟醅中的其他微生物可显著抑制该酵母产乙缩醛，而该酵母在乙醇、乙醛含量较低的糟醅中生成的乙缩醛较多，说明该酵母可促进乙缩醛缩合。同时，该酵母菌株在混菌发酵糟醅中的乙醛生成量高于纯菌发酵糟醅，可能是由于纯菌糟醅乙醇含量较低，由乙醇氧化生成的乙醛也较少。

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另外，该酵母菌株对异丁醛、生成糠醛的影响也与乙缩醛类似，但不显著，但该酵母仍倾向于增加异丁醛、糠醛的生成，可能对白酒产生不良风味。

图2 Z8Y-91对糟醅中醛类物质的影响(异丁醛的单位是mg/mL，乙醛、糠醛、乙缩醛的单位是mg/100mL；A、B分别表示与空白对照、纯菌发酵糟醅的差异达到极显著水平(P<0.01)，下同。)Fig.2 Fluctuation of aldehydes in fermentative grains caused by Z8Y-91( The unit of iso-butyl aldehyde is mg/mL, and mg/100mL for the acetaldehyde, furfural, acetal; A, B means P<0.01 compared with the control and the pure culture respectively, and the same below.)

2.2.2 Z8Y-91对糟醅中高级醇生成的影响

从表1可知，接种Z8Y-91的混菌发酵糟醅中正丁醇含量显著高于纯菌发酵醩醅，除乙醇外的总醇生成量明显高于纯菌发酵糟醅，可能是因为醩醅灭菌后整个发酵体系的发酵力降低，而酵母是影响高级醇生成的重要因素。

表1 Z8Y-91对糟醅中醇含量的影响 单位：mg/100mL

与空白相比，接种Z8Y-91的混菌发酵糟醅中除乙醇外的醇类物质含量高于空白对照，说明Z8Y-91对混菌体系中醇类物质生成有一定影响，虽未达到显著水平，但多轮次发酵累积后可能会最终增加浓香型白酒的高级醇含量。并且，该菌株还可能增加甲醇的生成量，体现在接种该菌株的纯菌及混菌发酵糟醅中的甲醇含量均高于空白糟醅，但3种发酵体系中甲醇生成量均低于国标限量(≤ 0.6 g/L)[17]。

2.2.3 Z8Y-91对糟醅中有机酸、酯类物质生成的影响

从表2可知，与接种酵母菌株的灭菌糟醅相比，混菌发酵糟醅的酸度基本没有变化，但4种主要有机酸总含量及其对应酯的总生成量均较高，原因可能是糟醅灭菌后导致产酸菌减少，酯化酶被灭活，且灭菌过程中酸、醇挥发损失也减少了酯的生成量。

表2 Z8Y-91对糟醅中有机酸和酯生成的影响 单位：mg/100mL

与空白对照相比，混菌发酵糟醅中己酸含量显著增加，但己酸乙酯含量却略有降低，可能是因为Z8Y-91削弱了己酸菌的酯化力。混菌发酵糟醅与空白对照酸度非常接近，但4种主要有机酸、酯总含量较低，说明Z8Y-91可在一定程度上削弱糟醅浓香风味。

2.3.1 Z8Y-91对糟醅中真菌区系的影响

如表3所示，2个样本高通量测序的序列覆盖率均超过97%，能够很好地反映菌群真实情况。接种Z8Y-91后有效序列条数增加了79.3%，但OTU数量减少了77.3%，同时香农指数和ACE指数表明该酵母降低了糟醅中真菌的多样性及丰富度，对种属数量的统计也证实了这一点，接种该酵母菌株后，糟醅中的真菌属从96个下降到54个，种从150个下降到67个。

表3 Z8Y-91对真菌区系多样性的影响

从图3可以看出，接种L.elongisporus菌株Z8Y-91后，该酵母丰度达97.5 %，表明该菌株对混菌发酵糟醅适应能力较强，对糟醅中原有酵母种属具有一定的生态优势，同时对糟醅真菌区系影响较大，表现在优势酵母Zygosaccharomyces属大幅度减少，Chloridium、Fusarium、Lecythophora等属的丰度也不同程度的降低。

图3 Z8Y-91对糟醅中真菌区系构成的影响Fig.3 Influence on fungus flora in fermentative grains caused by Z8Y-91

2.3.2 Z8Y-91对糟醅细菌区系的影响

由表4可知，2个样本高通量测序的序列覆盖率在90%左右，能够较好地反映菌群真实情况。接种Z8Y-91后糟醅中有效序列条数增加了3.6%，但OTU数量减少了33%，同时细菌群体多样性降低，细菌属从593个减少到400个，减少了32.5%，种从520个减少到272个，减少了47.7%。

从图4可以看出，接种L.elongisporus菌株Z8Y-91后优势属Lactobacillus的丰度上升至81.77%，而Pseudomonas属明显减小，丰度<1%的属(other)减少，这与表6中细菌属的个数从593个降低到400个是一致的，说明该菌株可促进Lactobacillus优势属的生长，但会通过抑制某些非优势种属细菌生长来降低群体多样性。

表4 Z8Y-91对细菌区系多样性的影响

图4 Z8Y-91对糟醅中细菌区系构成的影响Fig.4 Influence on bacteria flora in fermentative grains caused by Z8Y-91

3 结论与讨论

自然混菌固态发酵的影响因素和不确定因素较多，且其发酵基质不均匀，因此其微生物发酵机理的研究一直较为滞后，本研究通过强化接种1株L.elongisporus酵母到混菌发酵糟醅中，来探究该酵母菌在浓香型白酒发酵过程中可能的作用，并评价其潜在的应用价值及应用风险，在本实验条件下，可得出以下结论：

(1)强化接种该酵母不影响淀粉糖化，但对糟醅发酵力有一定影响，同时显著抑制蛋白质分解；

(2)该酵母倾向于增加乙缩醛、己酸、糠醛、异丁醛、乙缩醛、甲醇的生成，其中乙缩醛、己酸达到显著水平；

(3)该酵母在混菌发酵糟醅中具有很好的生态优势，强化接种后可降低糟醅真菌多样性和丰富度，对细菌多样性也有不利影响。

综合上述研究结果，我们认为，尽管该分离自浓香型白酒糟醅的酵母菌株与浓香型白酒风味的形成有一定关联(增加乙缩醛、己酸的生成)，但其对酿造微生物生态环境可能造成不利影响，要将其用于生产，尚需在多家白酒企业的多轮次生产中跟踪验证，并通过调整酵母的接种量、接种方式等优化应用方案，趋利避害，改善浓香型白酒风味。

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DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703003

Influences of aLodderomyceselongisporusstrain on fermentation of strong-flavored liquor

YOU Ling1,2,LI Mei-hua1,WANG Zhi-yao1,MEI Ling-li1, SUN Xue-qin1,YU Li-chen1,WANG Tao1,2*

1(College of Life Science and Food Engineering, Yibin University, Yibin 644000, China) 2(Key Laboratory of Sichuan Province for the Utilization of Solid State Fermentation Resources, Yibin University, Yibin 644000, China)

In order to explore the role of aLodderomyceselongisporusyeast in the strong-flavored liquor fermentation, the strain was inoculated to fermentation grains, the fluctuation of physicochemical indexes, flavor substances and microflora in fermented grains were then analyzed after fermentation for 50d. It was found that the addition of this yeast strain significantly increased the content of reducing sugar and decreased the amino-N, and promoted the formation of acetal and hexanoic acid. Furthermore, the fungus diversity in fermentative grains considerably reduced when enhanced by the yeast strain,L.elongisporusbecame dominant strains instead ofZygosaccharomyce. Meanwhile, bacteria diversity was slightly influenced, as the dominant genus, the frequencies ofLactobacillusincreased while Pseudomonas decreased. The results indicated thatL.elongisporuscould change the flavor of Strong -flavored liquor, and might result in unpredictable sustained influences on continuous fermentation.

Lodderomyceselongisporus; strong-flavored liquor; enhancement; influences; microflora

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703002

博士，助理研究员(王涛教授为通讯作者,E-mail：289615848@qq.com)。

固态发酵资源利用四川省重点实验室项目(2015GTC001)；宜宾学院博士启动项目(2016QD09)；大学生创新项目(201510641015)

2016-08-19,改回日期：2016-09-29