熟地寄生壮骨方对大鼠创伤性骨关节炎模型抗炎及保护软骨作用的实验研究*
2017-04-22林洁华周颖燕徐侦雄何晓红陈更新陈玉兴赵自明何羿婷
林洁华,周颖燕,徐侦雄,何晓红,陈更新,陈玉兴, 赵自明, 何羿婷△
(1. 广州中医药大学第二临床医学院,广州 510120;2. 广东省中医院风湿科,广州 510120;3. 广东省中医院新药开发办,广州 510120;4.广东省中医药科学院,广州 510120)
熟地寄生壮骨方对大鼠创伤性骨关节炎模型抗炎及保护软骨作用的实验研究*
林洁华1,周颖燕1,徐侦雄2,何晓红2,陈更新3,陈玉兴4, 赵自明4, 何羿婷3△
(1. 广州中医药大学第二临床医学院,广州 510120;2. 广东省中医院风湿科,广州 510120;3. 广东省中医院新药开发办,广州 510120;4.广东省中医药科学院,广州 510120)
目的:观察熟地寄生壮骨方对大鼠创伤性骨关节炎模型的影响,探讨其抗炎及保护软骨作用。方法:采用创伤性膝骨关节炎大鼠模型,切取病变膝关节制备膝关节匀浆液,测定给药前后一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的含量;病变膝关节组织病理切片,按Mankin骨关节炎组织分类法进行评分。结果:与空白组比较, 模型组大鼠膝关节NO、TNF-α含量显著增大,大鼠膝骨关节Mankin评分值显著增大;与模型组比较, 熟地寄生壮骨方各组NO、TNF-α含量均明显减小,大鼠膝骨关节Mankin评分值均明显减小。结论:熟地寄生壮骨方能降低创伤性骨关节炎模型大鼠膝关节NO、TNF-α含量及改善其软骨形态,达到控制炎症及保护软骨的目的。
创伤性膝骨关节炎;模型;熟地寄生壮骨方;抗炎;软骨形态
创伤性骨关节炎(Post-traumatic osteoarthritis) 是骨关节炎的常见类型之一[1],是由创伤引起的以关节软骨退化变性和继发软骨增生、骨化为主要病理变化,以关节疼痛、活动功能障碍为主要临床表现的一种疾病[2]。近年来, 随着外伤、交通事故的增多,关节软骨的损伤概率增大,创伤性骨关节炎的发病率有增加趋势[3]。至今人们对软骨损伤后的自然演变过程还不够了解,创伤性骨关节炎的发病机制仍不清楚[4]。
中医学认为创伤性骨关节炎属于“气滞血瘀”“风寒湿痹阻”痹症范畴。熟地寄生壮骨方以祛瘀通络、补益肝肾、益气养血、祛风除湿为法,扶正驱邪、补中寓通使气血合而筋骨通,肝肾强而痹痛愈,临床应用多年疗效确切。本研究以观察熟地寄生壮骨方对创伤性膝骨关节炎模型大鼠的影响为目的,进一步寻求熟地寄生壮骨方治疗创伤性膝骨关节炎的实验证据。
1 材料
1.1 药物
熟地寄生壮骨方提取物(熟地、桑寄生、骨碎补、苏木、海风藤)由广东省中医研究所制剂研究室提供。使用时按剂量以蒸馏水配制成所需浓度,4℃冰箱保存。必理通(对乙酰氨基酚片),中美天津史克制药有限公司(批号11012605);壮骨关节丸,三九医药股份有限公司(批号1103111S)。
1.2 试剂
甲醛,广州化学试剂厂(批号20120811-1);一氧化氮(NO)试剂盒,南京建成生物工程研究所提供(批号20130614);TNF-α ELISA试剂盒,上海西唐生物科技有限公司(批号20130103);无水乙醇,天津化学试剂科贸公司(批号20120714)。
1.3 仪器
JJ3000动物电子秤,G&G公司产品;BS224S电子天平(1/万),德国SARTORIUS产品;YD62 型石蜡包埋机,浙江金华益迪产品;Leica RM2235轮式切片机,德国莱卡公司产品;Leica TP 1020型全自动脱水机,德国莱卡公司产品;YD-AB型摊烘烤片机,浙江金华益迪产品;YD-6L型智能冰冻包埋机,浙江金华益迪产品;Shandon Gemini染色机,德国Thermo公司产品;DHG-9203型电热恒温干燥鼓风干燥箱,上海精密实验设备厂产品;Olympus DP2-BSW型病理图像采集系统,日本奥林巴斯公司产品。
1.4 动物
SPF级SD大鼠雌雄各半,体质量180~220 g,由广东省医学实验动物中心提供(动物生产许可证号SCXK(粤)2008-0002,实验动物质量合格证号№44007200002932)。动物实验环境:广东省中医研究所SPF级动物实验室(设施使用许可证号SYXK(粤)2010-0059)。
2 方法
2.1 动物分组
取SPF级SD大鼠70只雌雄各半,按体质量随机分为空白对照组、模型对照组、必理通片组、壮骨关节丸组、熟地寄生壮骨方高、中、低剂量组7组。
2.2 剂量设置
参考《中药药理研究方法学》中剂量换算方法“体表面积比”换算动物临床等效剂量,并以此作为大鼠药效学实验剂量。必理通片大鼠药效学实验剂量为0.270 g/kg,壮骨关节丸大鼠药效学实验剂量为1.080 g/kg,熟地寄生壮骨方处方量为155 g生药,等效剂量为13.950 g/kg,考虑给药浓度和给药体积,设计熟地寄生壮骨方大鼠药效学高剂量为27.900 g/kg,中剂量为13.950 g/kg,低剂量为6.975 g/kg(分别为2倍临床等效剂量、临床等效剂量、1/2临床等效剂量)。实验时以蒸馏水按剂量配制成所需浓度,4℃冰箱保存。
2.3 统计学方法
2.4 给药方法
熟地寄生壮骨方各剂量组及阳性对照药按剂量灌胃给药,给药体积10 ml/kg,每天1次,对照组同法灌胃给予蒸馏水10 ml/kg。
2.5 测定方法
除正常对照组大鼠外,其余各组大鼠均采用切除内侧副韧带和内侧半月板法(膝内关节炎经典动物模型-Hulth 模型)复制大鼠创伤性膝骨节炎模型,正常对照组切开后不切除内侧副韧带和内侧半月板,术后连续3 d青霉素20万U肌肉注射,1周后各给药组开始给药,正常对照组、模型对照组给予等体积蒸馏水,每天1次,连续8周。末次给药后1 h处死大鼠,取同部位病变膝关节,大体观察后小心切取小块同部位病变膝关节,仔细去除骨头和皮肤称重,在冰浴下以电动研磨器制作 20 %匀浆液,2000 r/min 离心 10 min取上清液,采用 ELISA 法测定NO、TNF-a含量。取同部位病变膝关节组织常规固定、脱钙、包埋、封片、染色,光镜观察后按Mankin骨关节炎组织分类法进行评分。
3 结果
3.1 熟地寄生壮骨方对创伤性膝骨关节炎大鼠膝骨关节NO、TNF-α含量的影响
表1显示,与空白对照组比较, 模型对照组大鼠膝骨关节NO、TNF-α含量显著增大(P<0.01);与模型对照组比较, 熟地寄生壮骨方高、中、低剂量组大鼠膝骨关节NO、TNF-α含量均明显减小(P<0.01)。
3.2 熟地寄生壮骨方对创伤性膝骨关节炎大鼠膝骨关节Mankin评分的影响
表1显示,与空白对照组比较, 模型对照组大鼠膝骨关节Mankin评分值显著增大(P<0.01);与模型对照组比较, 熟地寄生壮骨方高、中、低剂量组大鼠膝骨关节Mankin评分值均明显减小(P<0.01)。
3.3 熟地寄生壮骨方对创伤性膝骨关节炎大鼠膝骨关节组织病理学的影响
空白对照组大鼠关节软骨表面光滑,4层结构清晰可辨,软骨细胞排列整齐呈柱状,潮线完整,染色质分布均匀,细胞核清晰,深染均匀(图a)。
模型对照组大鼠关节软骨层变薄、粗糙,结构不易分辨,部分区域软骨细胞核固缩、坏死,偏于一侧,钙化层软骨细胞呈簇状,软骨细胞排列紊乱,潮线多不完整或完全消失,甚至软骨下骨质外露、软骨下骨囊变的形成(图b)。
表1 对创伤性膝骨关节炎大鼠膝骨关节NO、TNF-α含量及Mankin评分的影响±s)
注:与正常对照组比较:**P<0.01;与模型对照组比较:##P<0.01
熟地寄生壮骨方高、中、低剂量和阳性药必理通片、壮骨关节丸等治疗组在病变发生率、病变范围和病变严重程度方面与模型组比较均有降低或减轻,膝关节软骨组织在变性、簇聚和坏死方面均轻于模型组(图c-g)。
图1 各组大鼠膝关节病理形态比较(HE 染色 ×400)
3 讨论
Hulth 法模型为膝内关节炎经典动物模型[5],主要方法是麻醉后将动物膝关节前后交叉韧带及内侧副韧带切断,切除内侧半月板,术中避免损伤关节软骨,术后不固定伤肢,动物可自由活动,此方法借手术形成关节不稳从而诱发骨关节炎。半月板切除后会导致关节的不合槽运动,由于动物膝关节的正常力学轴线遭破坏,关节最大压力承受面由正常的外侧胫骨平台转至内侧胫骨平台与股骨内髁,加之韧带的破坏引起关节不稳定,局部关节软骨所承受的压力相对增加,从而促使关节软骨发生变性[6]。Hulth 法模型诱导成功率高,稳定性好,应用广泛,特别适用于膝关节内注射药物预防和减轻软骨病理改变的研究[7]。Welch等[8]发现,单纯切除内侧半月板前角的大鼠膝关节在6周内无明显改变,12 周后关节评分有显著改变;而同时内侧半月板部分切除模型中,6 周时即发现关节评分显著增加。本研究通过切除内侧副韧带和内侧半月板法复制大鼠创伤性膝骨节炎大鼠模型,造模后模型组膝骨关节NO、TNF-α含量及Mankin评分值显著增大,且各给药组与模型对照组比较,给药前膝骨关节NO、TNF-α含量及Mankin评分值均无明显差异,提示Hulth 法创伤性膝骨关节炎大鼠模型造模成功。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是机体免疫系统调节骨代谢的主要因子,是参与OA 发病进程中的重要介质[9]。另外,TNF-α能激活IL-6基因,诱导IL-6生成,产生进一步的炎症反应;又有学者报道, TNF-α主要影响滑膜炎症和免疫学反应,能诱发抗自身软骨的自身免疫反应[10]。还有研究表明,TNF-α是主要的炎性细胞因子,已有报道OA患者的滑膜内存在着高浓度的TNF-α,TNF-α能激活多型核细胞,刺激滑膜细胞产生前列腺素E2,促进软骨基质金属蛋白酶合成和分泌,引起关节软骨吸收、降解和破坏[11]。熟地寄生壮骨方可以明显减少膝骨关节TNF-α含量,从而达到抗炎、保护软骨的作用,起到治疗创伤性膝骨关节炎的作用。
一氧化氮与骨关节炎的发病机制密切相关[12-13]。正常情况下, 一氧化氮起宿主防疫作用, 但过量的一氧化氮可导致各种慢性炎症[14],增高的一氧化氮可协同各种细胞因子作用于关节软骨[15]。在关节炎时两者相互协同作用, 使病情加重, 阻断这一恶性循环的过程可以减轻关节软骨的损伤, 减轻病情。多项研究表明, 创伤性软骨退变与细胞凋亡密切相关。Hashimoto等[16]研究认为, NO 可能介导创伤后软骨细胞的凋亡。熟地寄生壮骨方可以明显地降低膝关节一氧化氮的含量,打破其恶性循环,从而保护关节软骨。
中医学认为创伤性骨关节炎属于痹症范畴, “气滞血瘀”“风寒湿痹阻”证为多见,病机为肾气不足、风寒湿邪侵入骨骼,或跌仆闪挫,伤损骨骼,以致气血瘀滞,运行失畅,筋骨失养,久之肌萎筋缩、骨节凝滞。熟地寄生壮骨方以祛瘀通络、补益肝肾、益气养血、祛风除湿为法,扶正驱邪,补中寓通,使气血足而筋骨通,肝肾强而痹痛愈,针对创伤性骨关节炎病因病机,临床应用多年疗效确切。
本研究在创伤性膝骨关节炎大鼠模型造模成功的基础上,探讨熟地寄生壮骨方对创伤性膝骨关节炎的治疗作用。研究结果提示,熟地寄生壮骨方明显降低大鼠膝骨关节NO、TNF-α含量,还可减轻模型组软骨病变发生率、病变范围和病变严重程度,改善软骨组织的变性、簇聚和坏死病变。Mankin评分亦说明,熟地寄生壮骨方可改善创伤性膝骨关节炎模型大鼠的软骨病理损害,并证实熟地寄生壮骨方有抗炎及改善软骨退变、保护软骨的作用,为临床治疗创伤性膝骨关节炎提供了有力的实验依据。
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Effects of Shudi Jisheng Zhuanggu Decoction on anti-inflammatory and Morphology of Articular Cartilage of Knee Post-traumatic Osteoarthritis Model Rats
LIN Jie-hua1, ZHOU Ying-yan1, XU Zhen-xiong2, HE Xiao-hong2, CHEN Geng-xin3, CHEN Yu-xing4, ZHAO Zi-ming4, HE Yi-ting3△
(1.TheSecondClinicalMedicalCollegeofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China; 2.Dept.ofRheumatism,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510120,China; 3.Dept.ofNewDrugDevelopment,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicineGuangzhou510120,China; 4.GuangdongProvincialAcademyofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510120,China)
Objective: To observe the anti-inflammatory effect and the morphology change of articular cartilage under intervention of Shudi Jisheng Zhuanggu decoction (SJZ) in knee post-traumatic osteoarthritis model rats. Methods: Rats were removed the medial collateral ligament and the medial meniscus to build models of knee post-traumatic osteoarthritis(Hulth’s modeling method)before administration of drugs. Prepared 20% homogenization buffer of the knees to measure the contents of nitric oxide (NO) and TNF-α.Histologic sections of cartilage were received HE staining and Gemini staining were evaluated according to Mankin cartilage histological score. Results: Mankin score and the contents of NO and TNF-α were significantly increased in model group compared to control group. Mankin score and contents of NO and TNF-α of SJZ groups were significantly decreased compared to model group. Conclusion: SJZ can control inflammation and ameliorate morphology of articular cartilage in rats with knee Post-traumatic osteoarthritis, so as to protect the cartilage and delay cartilage degeneration.
Knee post-traumatic osteoarthritis; Model; Shudi Jisheng Zhuanggu decoction; Anti-inflammation; Morphology of cartilage
广东省科学技术厅—广东省中医药科学院联合科研专项(2011B032200016)-熟地寄生壮骨方治疗膝骨性关节炎的组方优化研究
林洁华(1990-),女,广东揭阳人,医学博士,从事中医药风湿病的临床与实验研究。
△通讯作者:何羿婷,主任医师,医学博士,博士研究生导师,从事中医药风湿病的临床与实验研究,Tel:020-81887233-39402,E-mail:yitinghe@126.com。
R285.5
B
1006-3250(2017)03-0411-04
2016-09-15