益艾康及HAART治疗对HIV感染者辅助受体CCR5/CXCR4表达的影响*

刘 真，李 强，邓博文，李承乘，桑 锋，徐立然

(河南中医药大学第一附属医院艾滋病临床研究中心，河南省病毒性疾病中医药防治重点实验室，郑州 450000)

益艾康及HAART治疗对HIV感染者辅助受体CCR5/CXCR4表达的影响*

刘 真，李 强，邓博文，李承乘，桑 锋，徐立然△

(河南中医药大学第一附属医院艾滋病临床研究中心，河南省病毒性疾病中医药防治重点实验室，郑州 450000)

目的：探讨益艾康及HAART治疗对艾滋病病毒感染者辅助受体CCR5/CXCR4表达的影响及辅助受体表达与HIV疾病进展的关系。方法：收集65例HIV感染者及10例健康对照抗凝全血，采用流式细胞技术检测各样本T细胞表面CCR5、CXCR4表达水平。HIV感染者按治疗情况分为未治疗组、益艾康治疗组、益艾康合并HAART治疗组3组，比较不同组别间辅助受体表达水平。结果：HIV感染组CD4+T淋巴细胞表面CCR5表达高于对照组，CXCR4表达低于对照组。相关分析显示，CCR5表达与CD4+T细胞数成负相关，与病毒载量成正相关；CXCR4表达与CD4+T细胞数成正相关，与病毒载量成负相关。HIV感染者不同治疗组辅助受体表达水平结果显示，益艾康治疗可部分恢复辅助受体的表达水平，HAART治疗可增强益艾康疗效。结论：益艾康治疗可降低艾滋病感染者辅助受体CCR5的表达，增加辅助受体CXCR4的表达，可部分改善艾滋病病毒感染后的免疫损伤。 关键词： 人类免疫缺陷病毒；益艾康；CC趋化因子受体5；CXC趋化因子受体4

艾滋病即获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)感染引起的以T淋巴细胞免疫功能缺陷为主的一种免疫缺陷病[1]，HIV-1感染人体除通过结合T细胞表面的CD4分子外，还需和辅助受体相结合才能进入靶细胞，HIV-1病毒株进入细胞的辅助受体主要有CCR5和CXCR4[2]。目前基于HIV/AIDS感染后CD4+、CD8+T细胞表面CCR5和CXCR4的表达情况研究报道较多，但学者们并未取得统一性结论[3-4]。益艾康胶囊是治疗艾滋病的临床经验方，已在国家中医药管理局艾滋病救治项目(河南)中推广使用。临床研究表明，该制剂具有健脾益气、养血解毒之功效，在临床推广中显著提高了艾滋病患者的免疫力[5-6]。本研究以不同治疗方案的HIV感染者作为研究对象，分析T细胞表面辅助受体表达水平与HIV疾病进展关系以及不同治疗方案人群辅助受体的表达情况，探讨益艾康治疗对艾滋病病毒感染引起免疫损伤的重建作用，从辅助受体的角度初步了解益艾康的作用机制。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2011年3月至2013年12月在河南中医学院第一附属医院艾滋病门诊收治的经河南省疾病预防控制中心确诊的HIV-1感染者，诊断均符合2011版本的艾滋病诊疗指南[7]。回顾性分析65例病人的治疗情况，其中未治疗组11例，益艾康治疗组32例，益艾康合并HAART治疗组22例，病人的主要病症有发热、咳嗽、腹泻、乏力、纳呆、皮疹等。未治疗组未服用任何药物；益艾康治疗组服用益艾康，服用方法为每日3次，每次5粒，疗程6个月以上；益艾康合并HAART治疗组在口服HAART药物的基础上服用益艾康胶囊。健康对照人群10例，全部来自河南中医学院第一附属医院健康体检者，这几组人群在性别和年龄是均衡可比的。所有样品均在受试对象知情同意的情况下采集静脉血。

1.2 CD4+T淋巴细胞绝对计数检测

已标记好的Trucount管中加入20 μl 抗- FITC-CD3、抗-PE-CD4、抗-PerCP-CD45、抗- APC-CD8混合抗体(BD公司)，后加入50 μl充分混匀的全血，振荡混匀，室温避光20 min。然后加入450 μl 1 × FACS裂解液，立即振荡混匀，室温避光裂解10 min至溶液澄清。利用FACS Calibur流式细胞仪进行检测，采用MultiSet软件收集细胞并同时进行分析，得到淋巴细胞亚群相对及绝对计数。

1.3 血浆病毒载量测定

采用COBAS AMPLICOR HIV-1定量检测试剂盒(Roche公司)在COBAS AMPLICOR全自动PCR检测仪上定量测定感染者血浆中HIV-1 RNA含量，病毒载量检测下限为20 copies/ml。

1.4 T淋巴细胞表面辅助受体CCR5、CXCR4表达水平的测定

取100 μL EDTA抗凝新鲜外周血，加入10 μL FITC-CD8 Ab(BD)、5 μL PE-Cy7-CD4 Ab(BD)、5 μL PE-CXCR4 Ab(BD)、5 μLAPC-CCR5 Ab(BD)。混匀后室温避光标记20 min，然后加入2 ml溶血素，立即振荡混匀，室温避光10 min至溶液澄清，1500 r/min离心10 min(离心半径为13.5 cm)，除去未结合的荧光抗体，后洗涤细胞(2ml PBS，1500 r/min离心10 min)，将染色好的细胞重悬于300 μL的PBS中，用BD CantoⅡ流式细胞仪获取数据，Flowjo软件分析CCR5+/CD4+、CXCR4+/CD4+、CCR5+/CD8+、CXCR4+/CD8+表达水平。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 健康人群与HIV感染者CD4绝对计数、血浆病毒载量、辅助受体表达情况比较

表1显示，HIV-1感染者CD4+T淋巴细胞计数低于健康人群，差异有统计学意义(P=0.01)；健康人群CD4+T淋巴细胞表面CCR5水平低于HIV感染人群(P=0.038)，CXCR4表达水平高于HIV感染人群，差异有统计学意义(CXCR4+/CD4+，P=0.015；CXCR4+/CD8+，P<0.001)。HIV感染者血浆病毒载量均值(中位数)为11000 copies/ml，四分位间距(21.8，36050)。

表1 健康人群与HIV感染者CD4绝对计数、辅助受体表达水平比较±s)

2.2 HIV-1感染者CCR5+/CD4+、CXCR4+/CD4+、CCR5+/CD8+、CXCR4+/CD8+表达水平与疾病进展的相关性

为研究HIV感染者外周血辅助受体的变化特征，探讨其是否与HIV疾病进展和病毒复制具有相关性。本研究分析了感染者体内CCR5+/CD4+、CXCR4+/CD4+、CCR5+/CD8+、CXCR4+/CD8+表达水平与CD4+T淋巴细胞计数和病毒载量的关系。结果显示，CCR5+/CD4+、CCR5+/CD8+与CD4+T细胞数成负相关，与病毒载量成正相关；CXCR4+/CD4+、CXCR4+/CD8+与CD4+T细胞数成正相关，与病毒载量成负相关。虽仅有3组变量之间差异有统计学意义，但所有均有相关的趋势(见图1)。

图1 HIV-1感染者辅助受体表达水平与CD4+T淋巴细胞计数和病毒载量的相关性

2.3 不同治疗方案人群辅助受体CCR5、CXCR4表达水平的比较

为揭示益艾康及HAART治疗对辅助受体表达的影响，我们分析了不同治疗方案组别之间辅助受体CCR5、CXCR4表达水平。结果显示，随着组别的依次递增，CCR5+/CD4+(%)逐渐下降，CXCR4+/CD4+(%)和CXCR4+/CD8+(%)逐渐上升。CCR5+/CD4+(%)、CXCR4+/CD4+(%)和CXCR4+/CD8+(%)的表达在4组之间存在统计学差异(具体两两比较见表2)。研究结果显示，益艾康治疗可部分恢复辅助受体的表达水平，HAART治疗可增强益艾康的疗效作用。

表2 不同治疗方案人群辅助受体CCR5、CXCR4表达水平的比较±s)

注：与健康对照组比较:#P<0.05；与未治疗组比较:▲P<0.05；与益艾康治疗组比较:■P<0.05

3 讨论

艾滋病自1981年美国首次报道以来，人们不断研究它的发病原因、病理机制和防治方法。1996年[8]人体趋化因子受体5(CCR5)的成功克隆，使人们发现在感染初期，HIV-1感染人体除通过结合T细胞表面的CD4分子外，还需结合辅助受体CCR5才可感染并进入靶细胞。随着研究的进一步深入,越来越多的辅助受体被证实与HIV感染有关。

趋化因子受体主要分布在机体免疫细胞表面，属于G蛋白偶联受体，具有7个跨膜片段。趋化因子受体与相应的趋化因子结合，通过和异源三聚体的G蛋白结合来传递信息，诱导免疫细胞向趋化因子的来源部位移动。根据结合的配体分为3个亚家族，即CXC类受体(CXCR)、CC类受体(CCR)和配体尚未明确的孤儿受体。HIV-1病毒株进入细胞的辅助受体主要为CCR5和CXCR4，此外少数病毒还可利用CCR2和CCR3等。 根据HIV-1感染不同细胞的能力将病毒分为巨噬细胞噬性病毒(M-tropic)、T细胞噬性病毒(T-tropic)和双重噬性病毒(Dual-tropic)。M嗜性病毒感染巨噬细胞和原始T细胞，但并不感染大多数传代T细胞系；T嗜性病毒能够感染原始T细胞和传代T细胞系，但并不感染巨噬细胞。HIV-1的细胞嗜性与辅助受体的利用有密切关系，M-tropic是无症状患者携带的主要病毒，主要利用CCR5又称为R5毒株，在病毒传播中起主要作用。T-tropic主要利用的辅助受体为CXCR4，称为X4毒株。Dual-tropic既可利用CCR5，又可利用CXCR4，被称为R5X4病毒株[9-10]。

目前基于HIV/AIDS感染后CD4+、CD8+T细胞表面CCR5和CXCR4的表达情况的研究报道较多，但研究者并未取得统一性结论[3-4]。有研究提示，我国HIV/AIDS患者CD4+、CD8+T细胞表面CCR5表达增高，CD8+T细胞表面CXCR4表达下降。传统的抗病毒治疗可影响HIV-1辅助受体的利用情况及辅助受体的表达水平。在治疗人群中，X4毒株的利用要高于非治疗人群和新近感染人群，在未治疗人群中CD4计数的下降与辅助受体的转化有关，但经过CD4计数的标准化处理后，治疗人群的X4利用率仍然要高于未治疗人群。本研究总结分析了65例HIV-1感染者的辅助受体与CD4+T淋巴细胞计数和血浆病毒载量的关系，并探讨其表达水平的变化与HIV-1感染疾病进展的关系。本研究是基于HIV不同治疗方案的临床试验，深入探讨了不同治疗方案HIV感染者辅助受体CCR5/CXCR4的表达水平，结果真实可信。

本研究结果表明，HIV-1感染后T细胞表面CCR5和CXCR4的表达与疾病进展和机体免疫反应密切相关，益艾康治疗可能会在一定程度上改善机体免疫功能，从而影响CD4+、CD8+T淋巴细胞表面CCR5和CXCR4的表达水平。HIV感染导致辅助受体表达水平变化的确切机制目前尚不明确，可能与HIV感染后引起机体应激性异常免疫反应有关。第二受体CCR5主要表达在活化的淋巴细胞表面，而CXCR4则主要表达在静息细胞表面。在HIV感染中，淋巴细胞表面CD38和HLA-DR表达上升，活化明显增高，因而导致辅助受体CCR5表达相应增高，CXCR4表达降低[11]。但HIV感染引起辅助受体变化的确切机制还有待进一步研究。

综上，随着疾病进展，HIV感染者淋巴细胞表面第二受体的表达出现了明显的变化，检测CD4+T淋巴细胞计数，同时结合辅助受体的变化，可能会更好地反映HIV感染者的免疫状态。益艾康治疗可部分恢复受体的变化，改善病人的免疫损伤，这为益艾康的作用机制研究提供了思路。

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Effect of Yiaikang and HAART on coreceptor CCR5/CXCR4 expression in HIV infectors

LIU Zhen, LI Qiang, DENG Bo-wen, LI Cheng-cheng, SANG Feng, XU Li-ran△

(KeyLaboratoryofViralDiseasePreventionandTreatmentofTCMofHenanProvince,DepartmentofAcquiredImmuneDeficiencySyndromeTreatmentandResearchCenter,theFirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofTCM,Zhengzhou450000,China)

Objective To study the effects of Yiaikang and highly active antiretroviral therapy (HAART) on coreceptor CCR5/CXCR4 expression and to investigate the relationship between the coreceptor expression and HIV disease progression. Methods:Enrolled 65 cases of HIV infected persons and 10 cases of healthy control, T cell surface CCR5/ CXCR4 expression levels were measured by flow cytometry. According to therapeutic method HIV infectors were divided into three groups: untreated group, Yiaikang treatment group, Yiaikang with HAART treatment group, coreceptor expression levels of different groups were compared. Results The expression of CCR5 in CD4+T cell surface of HIV infection group was higher than that of the control group; while HIV infection group coreceptor CXCR4 expression was lower than that of control group. Correlation analysis showed that CCR5 expression correlated negatively with CD4+T cell count and positively with viral load; CXCR4 expression correlated positively with CD4+T cell count and negatively with viral load. Comparing results of coreceptor expression levels in HIV different treatment groups showed Yiaikang treatment can partially restore the coreceptor expression levels and HAART can enhance the effect of Yiaikang. Conclusion:Yiaikang therapy can reduce coreceptor CCR5 expression, increase the expression of the CXCR4 coreceptor in HIV infectors,resultly partially improve the immune injury caused by AIDS virus infection.

Human immunodeficiency virus; Yiaikang; CCR5; CXCR4

河南省科技攻关计划(142102310511)；祛毒颗粒体外抗HIV-1病毒活性研究；郑州市科技攻关计划(20130991)；PD-1和Tim-3在HIV感染时增强表达的机制及扶正疗法对其表达水平变化的影响；河南中医学院科研苗圃工程项目(MP2013-13)；益艾康治疗对HIV-1感染者辅助受体CCR5、CXCR4表达水平的影响；河南省高等学校重点科研项目(15A360029)-基于Toll样受体通路探讨益元康治疗艾滋病的疗效机制研究；河南省中医药防治艾滋病专项(2012ZK07)；益艾康胶囊对HIV/AIDS患者淋巴细胞受体多样性变化的影响；河南省中医药科学研究专项(2015ZY02096)；清肺培元法对艾滋病合并肺部感染患者TH1/TH2免疫稳态的调控作用研究

刘 真(1985-)，女，河南郑州人，主管技师，医学硕士，从事艾滋病免疫学的临床与研究。

△通讯作者：徐立然，主任医师，教授，博士研究生导师，从事艾滋病中医药防治的临床与研究，Tel:0371-66288898,E-mail:xuliran666666@sina.com。

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1006-3250(2017)03-0375-03

2016-08-08