糖尿病大血管病变“气阴两虚”态模型的建立*

李海洋，覃海知，晁 俊，方传明，富晓旭，高 泓，谢春光△

(1．成都中医药大学临床医学院，成都 610075; 2．成都中医药大学附属医院，成都 610075)

【实验研究】

糖尿病大血管病变“气阴两虚”态模型的建立*

李海洋1，覃海知1，晁 俊1，方传明1，富晓旭1，高 泓2，谢春光2△

(1．成都中医药大学临床医学院，成都 610075; 2．成都中医药大学附属医院，成都 610075)

目的:建立糖尿病大血管病变“气阴两虚”态模型。方法:60只雄性GK大鼠(随机血糖>11.1 mmol·L-1)，按随机数字表法分为GK组、模型组、中药组各20只，另设正常Wistar大鼠20只为正常组。正常组、GK组喂饲普通饲料，模型组和中药组喂饲高脂饲料，造模同时中药组给予益气养阴中药治疗。5周后检测各组大鼠糖脂代谢、胰岛素抵抗指数(HOMA- IR)、血管内皮细胞凋亡和 Caspase-3表达等指标，光镜下观测大血管组织病理。结果:与正常组和GK组比较，模型组大鼠血糖、TC和TG、胰岛素抵抗、大血管内皮细胞凋亡和腹主动脉病理比较差异有统计学意义,与模型组比较中药组所有指标均有显著改善。结论:通过GK大鼠喂养高脂饲料的方法可制备糖尿病大血管病变“气阴两虚”态动物模型。

糖尿病大血管病变；气阴两虚；动物模型

糖尿病大血管病变指由糖尿病并发的心、脑及外周血管病变,占糖尿病患者死亡原因的 60%～70%，已经成为我国糖尿病发病率和致死率最高且危害最大的慢性并发症[1]。为方便实验研究，笔者采用高脂饲料喂养自发性2型糖尿病大鼠的方法，试图建立与临床相吻合的2型糖尿病大血管病变“气阴两虚”态模型并对其进行评价。

1 材料与方法

1．1 动物及饲料

SPF级空腹血糖≥11.1 mmol/L的10周龄雄性自发性2 型糖尿病GK大鼠，由中国科学院上海实验动物中心提供。高脂饲料配方由普通饲料88.2%、精炼猪油 10%、胆固醇1.5%、猪胆盐0.3%组成,四川省中医药科学院实验动物中心制成块料。

1．2 药物及试剂、仪器

参芪复方浸膏由人参、黄芪、生地黄、天花粉、山茱萸、山药等中药组成，1 g浸膏相当于原生药10 g,由四川省中医药研究院中医研究所药剂科生产(批号080928)。强生稳豪倍优血糖仪和血糖试纸为强生(中国)医疗器械有限公司产品;血清胰岛素试剂盒购自北京北方生物技术研究所；甘油三酯和胆固醇试剂盒购自温州东鸥津玛生物科技有限公司；实验动物饮用水处理MF-RO-5型,杭州永洁达净化科技有限公司产品；7170型全自动生化分析仪,日本日立公司生产；原位细胞凋亡TUNEL检测试剂盒由美国Roche公司生产； OLYMPUSB X50光学显微镜由日本OLYMPUS公司生产； Mias-2000图像分析系统由四川大学智胜软件股份有限公司生产。

1．3 动物分组及造模

80只GK大鼠适应性饲养 1周后, 随机血糖值11.1m mo l · L-1以上者60只入选本实验。 按随机数字表法分为GK组、模型组、中药组各20只，正常Wistar大鼠20只,另设正常组作为空白对照共4组。

造模同时开始给药,周期5周,正常组、GK组喂饲普通饲料，模型组和中药组喂饲高脂饲料。正常组、GK组、模型组均按5 ml/(kg· d)灌服生理盐水，中药组按 1.44 g/(kg· d) (相当于成人剂量的 10倍,成人按60 kg计)灌服中药混悬液。具体方法: 称取参芪复方浸膏7.2 g,加无菌水25 ml使匀,按5 ml/(kg· d)灌胃。大鼠造模给药35 d后处死,下腔静脉采集血样,并剥离胸、腹主动脉备检。

1．4 实验指标及检测方法

1.4.1 实验指标 观察动物的毛色、摄食、体质量、饮水、小便、大便、拉尾排便、神态、活动情况等症状，检测FBG、TC、TG、血清INS、血管内皮细胞凋亡和Caspase-3表达等。

1.4.2 平均荧光强度检测 采用原位末端标记Tunel法检测, 参照Roche原位细胞凋亡检测 POD试剂盒及浓缩型 DAB试剂盒操作, 激发光波长450～500 nm, 检测波长515～ 565 nm, 在荧光活体微循环显微镜系统下观察荧光染色结果, 每个组织>400× 视野下随机选5个视野, 平均荧光强度=累积荧光强度/发光物体的表面积。

1.4.3 Caspase-3表达 采用免疫组组织化学染色，用OLYMPUSB X50光学显微镜观察染色结果, 每张切片随机选5个视野, 输入Mias-2000图像分析系统,在200倍镜下分别测量内皮细胞 Caspase-3阳性物质积分光密度及平均光密度并计算其均值。

1．5 统计学方法

2 结果

造模过程中，因灌胃不当造成糖尿病对照组大鼠死亡1只，其余无异常。

2．1 大鼠症状比较

造模后，GK组、模型组大鼠均出现神疲、懒动或躁动、毛色黄而少泽、饮水摄食增多、尿量增多、生长增加减缓、拉尾排便、尾色变暗等糖尿病大鼠气阴两虚的共同特征，其中模型组的表现尤为明显。上述症状及体征在使用中药治疗反证后与模型组比较均有明显改善。

2．2 各组大鼠平均每日摄食和平均体质量比较(表2)

2．3 各组大鼠FBG、 TC、 TG、FINS、HOMA-IR结果比较(表3)

表1 各组大鼠症状情况

表2 各组大鼠平均摄食和平均体质量结果比较±s)

注：与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较:△P<0.05，△△P<0.01；与中药组比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01

表3 各组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、 TC、 TG结果比较

注：与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较:△P<0.05，△△P<0.01；与中药组比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01(HOMA- IR=(FBG × FINS)/22．5)

2．4 各组大鼠胸主动脉内膜凋亡内皮细胞平均荧光强度和腹主动脉内皮细胞caspase-3表达水平结果比较(表4、图1、2)

表4 各组大鼠胸主动脉内膜凋亡内皮细胞平均荧光强度和腹主动脉内皮细胞caspase-3表达水平结果比较±s)

注：与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较:△P<0.05，△△P<0.01；与中药组比较:▲▲P<0.01

图1 胸主动脉平均荧光强度结果注：从左到右依次为正常组、GK组、模型组、中药组

图2 腹主动脉caspase-3免疫组化染色(×200)注：从左到右依次为正常组、GK组、模型组、中药组

2．5 大鼠腹主动脉病理结果比较

图3显示，正常组大鼠腹主动脉内膜平坦,内皮细胞扁平,紧贴于平直的内弹力板上,中弹力板与平肌细胞整齐相间平行排列,内膜光滑整齐；GK组内皮细胞肿胀,未见明显脂质沉积；模型组腹主动脉病理显示，有大小不一的内膜增厚病灶，内皮细胞肿胀、数目增多，内皮下细胞浸润，内膜断裂不平整，脂质沉积比较明显，可见多个泡沫细胞；中药组腹主动脉内膜大部分无增厚，偶见内膜增厚病灶及泡沫细胞，数目较西药组少，内膜增厚处内皮细胞肿胀，内皮下细胞浸润及脂质沉积不明显。

图3 腹主动脉病理HE染色(×400倍)注：从左到右依次为正常组、GK组、模型组、中药组

3 讨论

糖尿病大血管病变属于中医学 “消渴”“痹症”等范畴，气阴两虚是本病的基本病机，故本实验以建立2型糖尿病大血管病变“气阴两虚”态模型为主要研究对象。

目前2型糖尿病的造模方法主要有自发形成、诱导形成及基因敲除等方法[2]。本研究在参考相关文献[3-10]后，采用自发形成糖尿病和诱导形成大血管病变相结合的造模途径。一方面，自发性糖尿病动物模型GK大鼠是通过重复数代近亲繁殖葡萄糖耐量处于上限的Wister大鼠而发展起来的。GK大鼠在发病后，明显出现类似于糖尿病病人“三多一少”的临床症状[11]。 研究指出，GK大鼠胰岛组织的形态学变化与2 型糖尿病发病机制相近，GK大鼠死亡率低，血糖维持水平与临床病人接近，动物的感染症状不明显。 研究结果说明，GK大鼠的优点更适合2 型糖尿病发病机制及其并发症的研究。另一方面，糖尿病及大血管病变的发生与饮食密切有关。《素问·奇病论》记载：“此肥美之所发也，此人必数食甘美而多肥也，肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴。”《素问·痹论》曰：“饮食自倍， 肠胃乃伤。”本研究在中医学理论指导下，采用高脂饲料喂养诱导模型大鼠的发生。GK大鼠为自发性糖尿病大鼠，既有先天不足的禀赋因素存在，又有本“虚”的特性，且处于“虚”态。GK大鼠通过高脂饮食诱导，类似于中医理论中肥甘厚味损伤脾胃，脾胃虚弱则气血生化乏源，在糖尿病“虚”态的基础上增加了气血不足的因素，先天不足加上后天乏源，故与中医气阴两虚病机有相似之处[12-14]。

研究结果说明，模型组大鼠明显出现血糖升高、血脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、大血管内皮细胞凋亡增加和大血管组织病理改变等情况，其发病过程及特征与糖尿病大血管病变的临床表现基本相似，属于2型糖尿病大血管病变早中期的典型特点。本研究和前期研究都发现，高脂饲料喂养的GK大鼠，其证候表现为精神萎靡、懒动或躁动、毛色枯黄、饮水摄食增多、尿量增多、生长增加减缓、拉尾排便、尾色变暗等，与人体“气阴两虚”证的临床表现具有相似性。模型大鼠的FBG、TC、TG、FINS、HOMA-IR升高，一是由于气虚不能转化体内精微物质所致，二是阴液不足不能稀释血液所致；胸主动脉平均荧光强度和腹主动脉caspase-3表达水平的升高，以及腹主动脉病理显示内膜增厚、细胞肿胀、细胞浸润、内膜断裂等表现，均是由于行于脉内的“营”阴不足不能濡养血管，气虚不能正常推动血液运行所致。在使用益气养阴的参芪复方后，中药组可观察到大鼠证候表现及血糖升高、血脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、大血管内皮细胞凋亡增加和大血管组织病理改变等情况均有明显的改善。这也从反面佐证了本研究中糖尿病大血管病变“气阴两虚”态模型的成功建立。

综上所述，本研究在自发性糖尿病GK大鼠基础上，再结合高脂饮食诱导的方式，初步建立了既符合现代医学 2 型糖尿病大血管病变特征、又含有中医学“气阴两虚”特点的病证结合大鼠模型。此模型与临床2 型糖尿病大血管病变气阴两虚型的临床表现、发病机制相似，且时间较短、死亡率低、成功率高，是研究2型糖尿病大血管病变“气阴两虚”态的成功模型。

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Establishment of the “Qi and Yin Deficiency” Model in the Diabetic Macrovascular Diseases

LI Hai-yang1， QIN Hai-zhi1， CHAO Jun1， FANG Chuan-ming1， FU Xiao-xu1， GAO Hong2， XIE Chun-guang2△

(1．ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine，ChengduSichuan610075,China; 2．AffiliatedHospital,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine，ChengduSichuan610075,China)

Objective: To establish models of Qi and Yin deficiency state and syndrome in diabetes mellitus macroangiopathy.Methods: 20 Wistar rats were included in the control group, while 60 male GK rats (random blood glucose >11.1 mmol/L)were randomly divided into GK group,model group and Chinese traditional medicine(TCM) group,20 rats in each group. Control group and GK group feed ordinary,model group and TCM group eat with high fat feed.TCM group had a Chinese medicine treatment at the same time. After 5 weeks, testing fasting blood ghcose、 fasting serum insulin (FINS), insulin resistance index (HOMA IR),Total cholesterol; triglycerides and vascular endothelial cell apoptosis;caspase-3 express;Light microscope observe pathology of the Abdominal aorta.Results: compared with the control group and GK group, the blood glucose, TC,TG, insulin resistance, vascular endothelial cell apoptosis, and large blood vessels tissue pathological have significant differences.Compared with the control group, TCM group all the indexes have improved significantly.Conclusion: By feeding the GK rats with high-fat feed,models of Qi and Yin deficiency state and syndrome in type 2 diabetes mellitus macroangiopathy was successfully established．

Diabetes mellitus macroangiopathy; Qi and Yin deficiency, Animal models

国家自然科学基金资助项目(81273749)-养阴益气活血法阻断糖尿病大血管病变GK大鼠代谢记忆的量效关系研究及表观遗传学机制；国家自然科学基金青年基金项目(81102589)-养阴益气活血法双向调控PI3-K信号系统对防治糖尿病大血管病变的拆方研究

李海洋(1985-)，男，江西信丰人，在读博士，从事中医药防治内分泌代谢病的临床与实验研究。

△通讯作者：谢春光(1964-)，男，教授，博士研究生导师，从事中医药防治内分泌代谢病的临床与实验研究，E-mail：xcg718@aliyun.com。

R587.1

B

1006-3250(2017)03-0325-04

2016-09-04