从醛固酮(ALD)的分泌与合成探讨硝菔通结方从肾论治便秘的作用机制*

梁星琛，周永学，闫曙光，张小波

(1.成都中医药大学，成都 610075；2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

从醛固酮(ALD)的分泌与合成探讨硝菔通结方从肾论治便秘的作用机制*

梁星琛1，周永学2△，闫曙光2，张小波2

(1.成都中医药大学，成都 610075；2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

目的：观察硝菔通结方对功能性便秘大鼠醛固酮(ALD)合成和分泌的影响，从现代医学肾脏调节水液代谢的角度揭示硝菔通结方从肾论治便秘的作用机制。方法：48只成年雄性SD大鼠采用随机数字表法分为空白组(8只)和造模组(40只)，造模组灌胃复方地芬诺酯混悬液6周复制便秘模型后随机分为模型组(FC组)、硝菔通结方高、中、低剂量组、阳性药物对照组(苁蓉通便口服液组，简称口服液组)。各治疗组给予不同剂量的硝菔通结方，阳性药物对照组给予苁蓉通便口服液(后简称口服液组)灌胃1个月。观察各组大鼠的一般情况以及结肠含水率，ELISA法检测各组大鼠血清中醛固酮(ALD)、肾素(PRA)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、血管紧张素转化酶(ACE)的含量,RT-PCR法检测肾脏组织中MRmRNA的水平，Western-Blot法检测结肠组织中AQP3的表达。结果：模型组大鼠粪便量少、质地干硬，结肠含水率明显降低，血清中ALD、PRA、AngⅡ、ACE的含量升高，肾脏组织中MRmRNA表达升高，结肠组织中AQP3的表达明显升高；与模型组比较，各剂量硝菔通结方治疗组以及口服液组大鼠粪便量增加且质地稀软，结肠含水率增高，血清中ALD、PRA、AngⅡ、ACE的含量均降低，肾脏组织中MRmRNA表达降低，结肠组织中AQP3的表达显著降低。结论：肾脏能通过调节ALD合成与分泌而影响肠道的水液代谢，这可能是中医从肾论治便秘的科学内涵之一，硝菔通结方可通过影响ALD合成与分泌调节肠道的水液代谢，从而对功能性便秘发挥治疗作用。

硝菔通结方；功能性便秘；ALD；RAAS

便秘是以排便次数减少、粪便量减少、粪便干结、排便费力等表现为主的一种复杂症状。现代研究表明，肠道水液代谢紊乱引起的肠道功能失常是功能性便秘形成的核心因素，调节肠道水液代谢成为功能性便秘治疗的关键[1-2]。硝菔通结方是周永学教授根据“肾主水司二便”理论创制的对功能性便秘临床疗效确切的方剂。前期研究发现，该方能有效调节肠道水液代谢，改善功能性便秘大鼠所出现的脱毛、毛色干枯、膀胱水液潴留、扎堆等与中医“肾虚”相关的症状，但其治疗肾虚的机制尚不清楚。中医学的“肾”主要是功能概念，其“主水司二便”的功能与现代医学肾脏调节水液的作用相类似。肾脏主要是通过调节水电解质的重吸收和分泌在水液代谢方面发挥重要作用，其对水液代谢的调节作用主要是通过调节醛固酮(ALD)的合成与分泌、涉及肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)来实现的[3]。因此本次研究拟以与肾脏水液代谢密切相关的ALD以及RAAS系统为切入点，观察功能性便秘发生时肠道水液代谢与该系统的变化，进一步观察硝菔通结方对其影响，以期从现代医学肾脏调节水液角度探讨中医“肾主水司二便”的科学内涵，揭示硝菔通结方从肾论治便秘的作用机制，现将研究结果报告如下。

1 材料

1.1 动物

清洁级雄性SD大鼠48只，体质量(200±20)g，购于中国人民解放军第四军医大学实验动物中心(许可证号SCXK-(军)2012-0007)。

1.2 药物及制备

硝菔通结方(芒硝30 g，鲜莱菔1000 g，肉苁蓉15 g，当归15 g，白术15 g)中鲜莱菔购于市场，其余中药饮片购于陕西兴盛德中药饮片有限公司，并经陕西中医药大学中药教研室鉴定合格。鲜莱菔切片水煮至熟烂捞出得浓汁，纳芒硝至完全融化，其他药物纳入同煎，浓缩至56 ml(19 g/ml)，灭菌后于4℃冰箱保存。复方地芬诺酯片(常州康普药业有限公司，批号1509020)粉碎后用蒸馏水配置成地芬诺酯混悬液，4℃冰箱保存。苁蓉通便口服液购于天水岐黄药业有限责任公司(批号20160323)。

1.3 仪器与试剂

ELX808型酶标仪(美国Bio-Tek公司)；KDC-40型低速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；高速冷冻离心机(日本日立CR22G II)；KDC-40低速离心机(科大创新股份有限公司)；全自动凝胶成像系统(美国ProteinSimple公司FC3)；大鼠血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)ELISA KIT、醛固酮(ALD)ELISA KIT、大鼠血管紧张素转化酶(ACE)ELISA KIT、大鼠肾素(PRA)ELISA KIT，以上试剂均来自伊莱瑞特生物科技有限公司；CDNA合成试剂盒、Q-PCR试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)；MR引物设计与合成(ABI公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海贝博生物公司)；RIPA组织细胞裂解液(北京碧云天生物技术研究所)；PMSF(江苏碧云天生物技术研究所)；TEMED(Sigma公司)；吐温20 (Tween20)(Sigma公司)；PVDF膜(Immobilon-P)；4×上样缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)；10×电转液(北京索莱宝科技有限公司)；ECL化学发光液(Biological Industries)。

2 方法

2.1 动物分组

清洁级雄性SD大鼠48只，按随机数字表法分为空白组(8只)和造模组(40只)，造模组灌胃复方地芬诺酯混悬液6周复制便秘模型，待大鼠出现明显的粪便量减少、粪便颗粒变小、粪质变干等便秘症状后再次采用随机数字表法分为功能性便秘模型组(FC组)、硝菔通结方高剂量组、中剂量组、低剂量组、苁蓉通便口服液组(简称口服液组)各8只。

2.2 动物模型建立

根据本课题前期实验中大鼠功能性便秘模型的建立方法，各组大鼠适应性喂养1周后，FC组、硝菔通结方各剂量组及口服液组给予10 ml/kg体积(1.5 mg/ml浓度)复方地芬诺酯混悬液灌胃，空白组以等体积生理盐水灌胃，每天1次，共给药6周。当大鼠出现精神状态差、进食减少、喜扎堆、粪便量少、质地干硬等表现时，为造模成功。

2.3 给药方法及剂量

造模结束后，空白组和便秘模型组正常饲养，并以0.9%生理盐水灌胃。根据大鼠与人之间的用药剂量换算方法，大鼠高、中、低剂量组给药量分别为高剂量380 g/kg，中剂量190 g/kg，低剂量95 g/kg。根据苁蓉通便口服液的临床等效剂量，口服液组给予苁蓉通便口服液每只0.3 mL/次灌胃。

2.4 实验技术与检测方法

2.4.1 一般情况观察 每日观察动物一般行为表现及排便情况。

2.4.2 ELISA法检测模型大鼠血中ALD、PRA、AngⅡ以及ACE的含量 末次给药2 h后，10%水合氯醛300 mg·kg-1ip麻醉，用真空采血负压管腹主动脉取血采血3～5 ml，室温放置30 min后，将KDC-40低速离心机调至3000 r·min-1离心10 min，10 min后分离待测血清，大鼠ALD、PRA、AngⅡ和ACE按ELISA试剂盒说明书步骤进行。

2.4.3 RT-PCR法检测肾脏MRmRNA的表达 按Trizol试剂盒提取肾脏总RNA测其浓度值并定量，然后进行逆转录。PCR引物由ABI公司的Primer Express Software v 2.0设计，MR引物上游：5′-TGCCATCCAGGATGTGGTTC-3′，下游：5′- GGCCAGTCACACCATTGGAG -3′，同时扩增β-actin为内参，其引物上游：5′- TCACCCACACTGTGCCCATC -3′，下游：5′- AGCTGTAGCCACGCTCGGTC -3′，实验严格按照说明书进行，PCR反应条件为95℃ 2 min，94℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 40 s，共40个循环。反应结束后上凝胶，电泳凝胶分析软件分析结果。各组MRmRNA的表达水平以相对表达量即MRmRNA与β-actin的比值来表示。

2.4.4 结肠含水率的测定 给药结束后，24 h内大鼠禁食不禁水，腹腔注射麻醉(10%的水合氯醛4 ml/kg),取肛门上方2 cm部位结肠组织，冰生理盐水清洗称取湿重，放置60℃恒温干燥箱干燥称其干重，计算结肠含水率。结肠含水率=(湿重-干重)/湿重×100%。

2.4.5 Western-Blot法检测大鼠结肠组织中AQP3的表达 RIPA裂解液提取结肠组织总蛋白充分震荡，冰上放置30 min，4℃12000 r/min离心3～5 min，收集上清液。采用BCA法进行总蛋白定量。SDS-PAGE凝胶电泳，每孔加入50 μg蛋白，用夹心法电转至PVDF膜上，封闭液(1×TBST，3%脱脂奶粉)室温封闭1 h。将一抗用封闭液(5%脱脂奶粉+TBST)稀释500倍，将洗好的膜放入塑料袋中加入稀释好的一抗4 ml进行孵育，4℃过夜。用洗涤液(1×TBST)洗涤3次，每次10 min。将二抗用封闭液(5%脱脂奶粉+TBST)稀释1000倍，将洗好的膜放入塑料袋中加入稀释好的二抗4 ml进行孵育，室温2 h。用洗涤液洗涤3 次，每次10 min，将膜平放于干燥的ECL发光板，将新鲜配置好的ECL发光液(A液2 ml+B液2ml)滴加到标记过的膜表面，采用全自动凝胶成像系统进行拍照。Western blot结果用光密度扫描分析软件分析各条带的光密度值，以积分光密度值(IOD)表示。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 一般情况表现

造模开始后大鼠出现精神状态差、倦怠倦卧、喜扎堆、食量减少、粪便量少、质地干硬等表现，部分大鼠出现小便不利或(和)被毛脱落且光泽度下降等表现。给药治疗后，硝菔通结方低、中、高剂量组大鼠上述症状逐渐减轻至消失，其中高剂量组最为明显。

3.2 对功能性便秘大鼠血清ALD含量的影响

表1显示，与空白组比较，模型组大鼠血清中的ALD含量升高(P<0.05)，表明便秘发生时肾脏的水液代谢亦受到影响；与模型组比较，硝菔通结方各剂量组与口服液大鼠血清中ALD含量明显降低(P<0.05)，表明硝菔通结方及苁蓉通便口服液能调节肾脏的水液代谢。

表1 硝菔通结方对功能性便秘大鼠血清ALD的影响±s)

注：与空白组比较:★P<0.05；与模型组比较:▲P<0.05

3.3 对功能性便秘大鼠RAAS系统的影响

表2显示， 与空白组比较，模型组大鼠血清中PRA含量显著高于空白组(P<0.01),血清中AngⅡ以及ACE含量均高于空白组(P<0.05)；与模型组比较，硝菔通结方各剂量组与口服液组大鼠血清中AngⅡ及ACE含量降低(P<0.05)，大鼠血清中PRA的含量显著降低(P<0.01)。

表2 硝菔通结方对功能性便秘大鼠血清PRA、AngⅡ以及ACE的影响±s)

注：与空白组比较:★P<0.05，★★P<0.01；与模型组比较:▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.4 对功能性便秘大鼠肾脏MRmRNA表达的影响

表3显示，与空白组比较，模型组大鼠肾脏MRmRNA表达升高(P<0.05)；与模型组比较，硝菔通结方各剂量组与阳性药物对照组大鼠肾脏MRmRNA明显降低(P<0.05)。

3.5 结肠含水率

表4显示，与空白组比较，模型组大鼠结肠含水率明显减少(P<0.01)，与模型组比较，硝菔通结方高剂量组及阳性药物对照组大鼠结肠含水率显著增多(P<0.01)，中剂量组和低剂量组大鼠结肠含水量增多(P<0.05)。

3.6 硝菔通结方对功能性便秘大鼠结肠组织中水通道蛋白3表达的影响

3.7 硝菔通结方对功能性便秘大鼠结肠组织中AQP3表达的影响

图1表5显示，与空白组比较，模型组大鼠结肠组织AQP3表达明显升高(P<0.01)，表明便秘发生时，由AQP3所介导的肠道水液代谢出现了紊乱；给药治疗后，与模型组比较硝菔通结方各剂量组以及阳性药物对照组大鼠结肠AQP3表达水平降低(P<0.05)，其中高剂量组大鼠结肠AQP3表达水平显著降低(P<0.01)。

表3 硝菔通结方对功能性便秘大鼠肾脏MRmRNA表达的影响

注：与空白组比较:★P<0.05；与模型组比较:▲P<0.05

表4 硝菔通结方对功能性便秘大鼠结肠组织含水率的影响±s)

注：与空白组比较:★★P<0.01；与模型组比较:▲P<0.05，▲▲P<0.01

图1 各组大鼠结肠AQP3的表达注：1.空白组；2.便秘模型组；3.硝菔通结方高剂量组；4.硝菔通结方中剂量组；5.硝菔通结方低剂量组；6.苁蓉通便口服液组

表5 硝菔通结方对功能性便秘大鼠结肠组织中AQP3含量的影响

注：与空白组比较:★★P<0.01；与模型组比较:▲P<0.05，▲▲P<0.01

4 讨论

现代医学研究表明，肾脏是人体水液代谢的核心，其对水液代谢的调节功能主要是通过影响水电解质的重吸收和分泌来实现的，肾脏的功能又受到激素的调节。在众多的调节激素中，ALD至关重要，具有调节肾脏对钠的重吸收、维持水平衡的作用。ALD的合成和分泌涉及RAAS系统，RAAS系统是体内分布最广的内分泌调节系统，具有直接或间接调节水电解质的作用，其中肾素(PRA)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、血管紧张素转化酶(ACE)为RAAS系统中的重要组成部分。PRA分泌增加可直接兴奋醛固酮的分泌，从而促进其发挥保钠保水的生理功能；另一方面作为RAAS系统的引发物，能将血浆中的血管紧张素降解，将血管紧张素原分解为AngI，通过血管紧张素转化酶的作用转化为AngⅡ，AngⅡ可通过协同作用促进钠的重吸收或对钠的转运有直接作用调节钠平衡[4]。同时，盐皮质激素受体(MR)是公认的与ALD结合的特异性受体，ALD与MR结合成为复合物，并通过核膜与核中DNA特异性结合位点相互作用，调节特异性mRNA转录，最终合成多种醛固酮诱导蛋白，使管腔膜对Na+的通透性增大，导致对Na+的重吸收增强，对水的重吸收和K+的排出量增加，从而发挥其保钠保水的作用[5-6]。AQPs是水分子蛋白，对维持机体水分子平衡具有重要作用，执行着各部位的水分重吸收、液体分泌和细胞内外的水平衡功能[7]。AQP3主要分布于结肠的黏膜上皮中。Yuan W T[8]等研究表明，AQP3在功能性便秘患者升结肠上表达升高，说明其在大肠内的异常表达导致结肠对水分的吸收过度，从而导致便秘的发生。钱海华[9]等经过研究证实，通便颗粒通过下调AQP3的表达，从而减少肠道对水分的吸收，增加粪便含水量来治疗功能性便秘。

中医学的病因病机体系中，便秘的发生病位在大肠，但与肾密切相关，肾的气化功能和肾精的滋养作用有关。《黄帝内经》中此观点尤为突出：“肾开窍于二阴”。肾主司二便，肾气足则气化有度，二便排泄正常，故《黄帝内经》认为大小便异常皆与肾有关。又肾主水，肾虚不能主持津液的排泄和分布，肠道津液不足也可导致排便困难。综上所述，功能性便秘的病机以肾虚津亏为主，故配伍用药应以补肾益精为胃肠传化之性提供动力，驱除浊邪以为胃肠传化之性肃清道路，从而恢复“大肠者，传道之官，变化出焉”。根据便秘的临床表现以及病因病机学说，周永学教授倡导功能性便秘从肾论治，温肾益精治其本，润肠通腑治其标，在此基础上创立了硝菔通结方(肉苁蓉、当归、芒硝、莱菔、白术)。该方参考《景岳全书》中济川煎的组方，在张锡纯硝菔通结汤基础上加入肉苁蓉、当归创制而成。四药合用，共奏温肾益精养血、软坚润下通便之功。且该方另一优势是各味药材均不含蒽醌类成分，无导致“泻剂结肠”之忧。经过长期临床应用证实，其疗效确切，明显优于对照组中成药，且未发现明显毒副作用[10]。前期实验研究表明，硝菔通结方治疗功能性便秘疗效确切，能有效纠正便秘大鼠肠道的水液代谢紊乱，然而目前从肾论治的本质及其调节水液代谢的深层机制尚不清楚。中医学的肾为功能概念，是多体系、多脏器共同作用的结果，其具有藏精、主生殖、主水、司二便等功能，其中肾主水司二便的功能与功能性便秘的发生密切相关。肾主水司二便的功能又与现代医学的水液代谢相对应，人体二便的产生与排泄均与水液代谢密切相关，而现代医学的肾脏是人体水液代谢的核心，因此对肾脏水液代谢的观察可部分反映“肾主水司二便的”的功能，从肾论治便秘有据可循。

本实验研究结果显示，功能型便秘大鼠血清中ALD、PRA、AngⅡ、ACE含量升高，肾脏组织中MRmRNA表达均升高，同时结肠含水率降低，结肠组织中的AQP3表达增高，说明RAAS系统的过度激活，导致ALD的合成与分泌加快，使得肾脏对水液的重吸收增加，导致肠中水液代谢也出现紊乱，从而引起便秘。硝菔通结方可使各组大鼠便秘症状得到明显改善，并降低血清中ALD、PRA、AngⅡ、ACE的含量，还可下调大鼠MRmRNA水平，同时增加结肠组织的含水率，抑制结肠组织中AQP3的过度表达。此研究结果表明，肾脏能通过调节ALD合成与分泌及RAAS系统而影响肠道的水液代谢，这可能是中医“从肾论治便秘”的科学内涵之一；硝菔通结方能通过影响ALD合成与分泌，抑制RAAS系统的过度激活，从而降低肾脏对水液的重吸收，纠正便秘大鼠肠道水液代谢紊乱而对功能性便秘发挥治疗作用。但ALD与RAAS系统是否直接作用于肠道中的AQP3，其机制又是什么，还需要进一步深入的研究。

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Functional Mechanism of aldosterone(ALD) Secretion and Synthesis of Xiao Fu Tong Jie Decoction on Treating Constipation from the Kidney

LIANG Xing-chen1，ZHOU Yong-xue2△，YAN Shu-guang2，ZHANG Xiao-bo2

(1.ChengduUniversityofChineseMedicine，Chengdu610075,China; 2.ShanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang,Shanxi712046,China)

To observe the influnce that Xiao Fu Tong Jie Prescription to treat functional constipation rats from the view of aldosterone’s synthesis and secretion.From the view of the kindney adjust water metabolism,we reveal the mechanism of action of nursing functional constipation from the kindey.Methods:48 SD rats were randomly divided into blank control group(8 SD rats)and functional constipation model group(40 SD rats).All were given compound diphenoxylate for 6 weeks and then divided into Xiao Fu Tong Jie Prescription high, medium, low dose group and positive drug group(Cong Rong Tong Bian oral liquid).These treatment groups were treated with different dose of Xiao Fu Tong Jie Prescription. Positive drug group was treated with Cong Rong Tong Bian oral liquid.All for one month. Observed the general condition of each group and the water content of the colon.The protein expression of the aldosterone(ALD)、renin(PRA)、angiotensinⅡ(AngⅡ)、angiotensin-converting enzyme(ACE)by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA). The mRNA and protein expression of MR were determined by Real-time PCR. The protein expression of the Western blot were used to detect the expression of AQP3 in colon. Results：Compared with the blank control group,the rats of model group had less feces and texture was hard.The water content of the colon levels were significantly decreased.ALD、PRA、AngⅡ、ACE content were increased.MR mRNA relative expression levels were increased. Levels of AQP3 relative expression levels were significantly increased；Compared with the model group,the rats of treatment groups had more feces and texture was loose.The water content of the colon levels were significantly increased.ALD、PRA、AngⅡ、ACE content were decreased.MR mRNA relative expression levels were decreased. Levels of AQP3 relative expression levels were significantly decreased after giving Xiao Fu Tong Jie Prescription and Cong Rong Tong Bian oral liquid.Conclusions:The kidney can affect water metabolism disorder in colon by adjusting ALD’s synthesis and secretion.This may be one of the scientific connotation of nursing functional constipation from the kindey；Xiao Fu Tong Jie Prescription can affect water metabolism disorder in colon by adjusting ALD’s synthesis and secretion to nursing functional constipation.

Xiao Fu Tong Jie Prescription；Functional Constipation；ALD；RAAS

国家自然科学基金资助项目(81273663)-基于VIP-CAMP-PKA-AQP3通路的硝菔通结方治疗功能性便秘的作用机制研究；国家课题重大专项(2012ZX09103201-037)-硝菔通结丸研制

梁星琛(1987-)，女，陕西咸阳人，在读博士,从事中医方剂学的临床与研究。

△通讯作者：周永学，教授，博士研究生导师，从事方剂配伍基础与临床研究，Tel:18691068166,E-mail: zhou8521@163.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)02-0338-04

2016-06-12