CRM197对人乳腺癌细胞侵袭及转移的抑制作用及机制

梁秋实，胡 宜（中国医科大学附属盛京医院：超声科，神经外科，辽宁 沈阳0004）

CRM197对人乳腺癌细胞侵袭及转移的抑制作用及机制

梁秋实1，胡 宜2（中国医科大学附属盛京医院：1超声科，2神经外科，辽宁 沈阳110004）

目的：研究CRM197对人乳腺癌细胞侵袭、转移能力以及对基质金属铁蛋白酶⁃2、9活性和磷酸化Akt表达的影响．方法：将浓度为10 μg／mL的CRM197孵育MDA⁃MB⁃231人乳腺癌细胞24 h．利用Transwell小室建立体外迁移及侵袭模型，观察CRM197对MDA⁃MB⁃231细胞迁移及侵袭能力的影响．利用明胶酶谱分析方法检测CRM197对MDA⁃MB⁃231细胞的基质金属铁蛋白酶⁃2、9活性改变情况．最后利用West⁃ern blot方法分析CRM197对MDA⁃MB⁃231细胞的磷酸化Akt表达水平的影响．结果：在10 μg／mL的 CRM197处理下，MDA⁃MB⁃231人乳腺癌细胞的侵袭和转移能力明显降低，同时基质金属铁蛋白酶⁃2、9活性以及磷酸化Akt的表达水平受到显著抑制．结论：CRM197能够通过抑制基质金属铁蛋白酶⁃2和9的活性而减弱人乳腺癌细胞的体外侵袭及迁移特性，并且在这一过程中PI3K／Akt信号通路发挥作用．

CRM197；乳腺癌；侵袭；迁移；基质金属铁蛋白酶；Akt

0 引言

乳腺癌是严重威胁女性健康的常见恶性肿瘤，是第二位导致死亡的妇科恶性肿瘤［1］．传统治疗方法是手术切除．但因乳腺癌具有侵袭及浸润的生长方式，往往具有卫星病灶及亚临床病灶，并且存在早期转移的特性，手术全切困难，并且极易复发．乳腺癌的重要生物学特性是侵袭及迁移，是该恶性肿瘤浸润生长并容易发生早期转移的重要原因［2］．目前手术后辅助放化疗已成为常规，但对乳腺癌的作用有限，并且往往具有较严重的全身并发症［3］．因此在乳腺癌的治疗中，开发效果更好、副作用更少的新型治疗药物十分重要．

交叉反应物质⁃197（cross⁃reactive materials 197，CRM197）是一种失活、无毒性的白喉毒素变异体，能与细胞膜上特定的白喉毒素受体（diphtheria toxin receptor，DTR）结合而发挥疫苗载体的作用［4］．研究发现CRM197能够抑制肝癌、胃癌等多种恶性肿瘤［5－7］．然而，CRM197在乳腺癌中的治疗作用及机制仍不明确．

在本研究中，首先观察CRM197对MDA⁃MB⁃231人乳腺癌细胞侵袭及迁移两种特性的影响，并通过调查其对金属铁蛋白酶⁃2（MMP⁃2）、金属铁蛋白酶⁃9（MMP⁃9）及下游磷酸化Akt（p⁃Akt）的作用初步探讨CRM197对人乳腺癌恶性生物学行为的作用以及机制．

1 材料和方法

1．1 MDA⁃MB⁃231细胞株的体外培养乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞株购自中国医科大学的实验中心．在含有10%胎牛血清（FBS）（天津灏洋生物技术有限公司）的DMEM⁃F12培养基（Hyclone，USA）中培养，培养环境为37℃、含5%CO2的恒温培养箱．

1．2 体外迁移模型的建立体外迁移模型的建立方法将具有聚碳酸酯膜的孔径为8 μm的Transwell小室（购自Coning Costar公司）放置在24孔板的孔中．首先利用0．25%胰蛋白酶消化处于80%融合的MDA⁃MB⁃231细胞，以无血清DNEM⁃F12培养基重悬胰酶消化的细胞，倒置显微镜下计数，将细胞密度为4×104／mL的细胞悬液200 μL接种于Transwell上室中，24孔板孔内置600 μL含10%FBS的DMEM⁃F12培养基．根据文献，CRM197在研究中的常用浓度为1～100 μg／mL［8］．在之前针对脑恶性肿瘤的研究中发现，10 μg／mL的CRM197能够明显抑制肿瘤细胞［9］．因此在本研究中，采用10 μg／mL作为CRM197的实验剂量．培养4 h，待细胞贴壁后实验组加入CRM197（10 μg／mL）．对照组的24孔板小孔内Transwell小室放置同样细胞密度及体积悬液，但不加入CRM197．培养24 h后，将Transwell小室取出，以无菌棉棒轻柔的去除半透膜上表面残留的MDA⁃MB⁃231细胞，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution：PBS）洗3次，然后利用甲醇和冰乙酸混合液（3∶1比例）固定30 min，根据Giemsa法染色15 min．轻轻甩掉染液，蒸馏水冲洗3次，在倒置显微镜下计数迁移到半透膜下表面的MDA⁃MB⁃231细胞数量．每组6孔，每孔随机计数6个200×视野内的细胞数，最后进行统计学分析．

1．3 体外侵袭模型的构建体外侵袭模型的建立方法同样采用8 μm孔径的Transwell小室及24孔板．与迁移模型不同的是，将Matrigel基质胶（美国BD公司）与DMEM⁃F12培养液按1∶7的比例稀释后，铺于Transwell小室聚碳酸酯膜的上表面，在无菌超净台内通风干燥．按照方法1．2中叙述，消化MDA⁃MB⁃231细胞后接种在Transwell上室之中．实验分组及处理方法同方法1．2所述．培养24 h后，取出Transwell小室，轻轻擦去膜上表面的残留细胞，Giemsa法固定染色，倒置显微镜下计数并统计学分析．

1．4 Western blot法测MMP⁃2、MMP⁃9及p⁃Akt的蛋白表达生长状态达到80%融合的MDA⁃MB⁃231细胞分为实验组和对照组．前者在培养体系中以浓度为10 μg／mL的CRM197处理24 h，对照组则不加入CRM197．首先用预先冰冷的PBS洗3次，细胞收集于离心管中，用RIPA裂解液（碧云天）在冰上裂解30 min，然后超声粉碎．在4°C温度下以15 000 g的离心力离心10 min，将蛋白上清液收集到新离心管中．利用BCA试剂盒（碧云天），以牛血清白蛋白为标准测定收集到的上清液的蛋白浓度．蛋白分离采用10%SDS⁃polyacrylamide gel electrophoresis（PAGE）凝胶电泳，每孔内的蛋白上样定量为25 μg．转膜后以兔抗人MMP⁃2、MMP⁃9多克隆抗体和小鼠抗人β⁃actin多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）封闭过夜．按1∶5000比例稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔及山羊抗小鼠二抗（中山金桥生物技术公司），在室温下孵育2 h．根据ChemiImager 5500 V2．03软件测定并计算MMP⁃2、MMP⁃9及p⁃Akt与β⁃actin的相对积分光密度比值并进行数学统计分析．

1．5 明胶酶谱分析MMP活性MDA⁃MB⁃231细胞的MMP⁃2和MMP⁃9的活性变化以明胶酶谱方法检测．分组方法及处理因素同方法1．4．根据说明书，酶谱分析利用含有0．1%明胶的 SDS⁃聚丙烯酰胺（Invitrogen，美国）．样品条带放置在含有0．1%Coo⁃massie R⁃250、40%乙醇及10%乙酸的溶液中，室温下固定30 min，然后在10%乙醇及7．5%乙酸的溶液中进行脱色2 h．最后利用Chemi Imager 5500 V2．03软件检测条带的光密度并进行统计学分析．

1．6 统计学处理采用SPSS13．0统计学软件进行数据分析．组间差异以±s表示，并经过配对t检验验证，以P＜0．05为差异具有统计学意义．

2 结果

2．1 CRM197对MDA⁃MB⁃231细胞迁移能力的影响本研究中，利用Transwell体外迁移模型实验观察CRM197对MDA⁃MB⁃231人乳腺癌细胞迁移能力的作用．与对照组相比，CRM197作用24 h后，转移到Transwell小室半透膜下表面的MDA⁃MB⁃231细胞的数量下降，差异有统计学意义（P＜0．05，图1A），意味着迁移能力受到显著抑制．

图1 CRM197对MDA⁃MB⁃231乳腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响

2．2 CRM197对MDA⁃MB⁃231细胞侵袭能力的作用利用 Transwell基质胶体外侵袭模型观察CRM197对MDA⁃MB⁃231细胞侵袭的作用．与对照组相比，加入10 μg／mL的CRM197的实验组中穿过Transwell基质胶半透膜到达下表面的细胞数量显著降低，说明CRM197显著抑制了人乳腺癌细胞的体外侵袭能力，差异有统计学意义（P＜0．01，图1C）．

2．3 CRM197对MDA⁃MB⁃231细胞的MMP⁃2、MMP⁃9水解酶活性的作用MMP⁃2与MMP⁃9是在乳腺癌细胞降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）而发生转移的过程中重要的两种蛋白酶，是乳腺癌恶性生物学行为相关的关键酶［10－11］．利用明胶酶谱分析方法进行酶动力性分析，结果显示与对照组相比，在 CRM197的处理下 MDA⁃MB⁃231细胞的MMP⁃2和MMP⁃9降解明胶中的底物蛋白的能力明显减弱（图2）．上述结果表明CRM197能够显著的抑制人乳腺癌细胞MMP酶的表达水平与水解酶活性．

图2 CRM197对MDA⁃MB⁃231乳腺癌细胞MMP⁃2和MMP⁃9酶活性的影响

2．4 CRM197对MDA⁃MB⁃231细胞p⁃Akt蛋白表达将CRM197作用于MDA⁃MB⁃231细胞24 h后，以Western Blot法调查MDA⁃MB⁃231细胞的磷酸化 Akt（p⁃Akt）的蛋白表达水平．与对照组相比，CRM197作用后MDA⁃MB⁃231细胞的p⁃Akt蛋白表达水平受到显著的抑制（P＜0．01，图3）．

图3 CRM197对MDA⁃MB⁃231乳腺癌细胞p⁃Akt表达水平的影响

3 讨论

乳腺癌的生长方式为浸润性生长，极容易发生局部或远隔转移，发生早期转移的病例约占全部患者的20%［12］．其治疗方法已经由传统的手术切除转向综合治疗［13－15］．乳腺癌极容易发生早期转移的生物学基础是其具有迁移和侵袭特性［16］．因此能够抑制乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力的治疗有助于控制乳腺癌的发展并改善患者的预后．CRM197是交叉反应物质家族中最重要的成员，能够结合并抑制肝素结合性表皮生长因子样生长因子（heparin⁃binding epidermal growth factor⁃like growth factor：HB⁃EGF）［4，17］．HB⁃EGF能够介导多种恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移［18⁃19］．同时HB⁃EGF还表达于人乳腺癌细胞，参与其恶性行为的调控［20］．作为HB⁃EGF的抑制物质，CRM197能够发挥抑制肿瘤的作用，如CRM197能够抑制肾上腺皮质癌、卵巢癌、进展期胃癌等恶性肿瘤［5，21－22］．然而，CRM197对人乳腺癌细胞转移及侵袭恶性的作用和机制尚不清楚．根据文献报道，10 μg／mL的CRM197能够明显抑制脑恶性肿瘤、人舌鳞癌细胞、肺癌细胞和肝癌细胞［9，23］．因此在本研究中，利用10 μg／mL的CRM197作用于人乳腺癌细胞，结果显示CRM197显著抑制人乳腺癌细胞的侵袭及转移能力．以上结果显示CRM197有望成为新的乳腺癌的治疗药物．

细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是肿瘤外部的屏障，恶性肿瘤发生浸润转移必须降解ECM．基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是降解ECM的重要蛋白酶．人乳腺癌组织高度表达MMP⁃2和MMP⁃9［10－11］．研究结果显示这两种基质金属蛋白酶受到抑制后，乳腺癌的转移能力明显下降［24］．本研究发现CRM197能够抑制MDA⁃MB⁃231乳腺癌细胞的MMP⁃2、9的表达与活性，表明降低基质金属蛋白酶活性，抑制其降解细胞外基质是CRM197遏制乳腺癌细胞迁移和侵袭的内在机制．磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶（phosphoinositide⁃3⁃kinase，PI3K）通路是与细胞生命活动密切相关的重要信号传导通路［25］．阻滞该通路可抑制乳腺癌细胞的增殖［26］．Akt蛋白是PI3K信号通路中重要的信号传导蛋白，PI3K信号通路的激活依赖于Akt磷酸化［27］．研究表明HB⁃EGF能够诱导Akt的磷酸化而使其活化［28⁃29］．因此推测CRM197的作用可能与Akt磷酸化水平改变有关．本研究的结果显示，CRM197能够明显下调MDA⁃MB⁃231细胞的磷酸化Akt的表达．相关研究证实PI3K信号通路参与调控MMP⁃2及MMP⁃9的表达［30］．汇总上述结果可以认为CRM197是通过抑制乳腺癌细胞PI3K／Akt信号通路而发挥抗肿瘤作用的．

综上所述，本研究发现CRM197能够通过抑制乳腺癌细胞的MMP⁃2和MMP⁃9的蛋白酶的表达与活性而明显降低乳腺癌细胞的侵袭和转移能力，该抑制作用可能通过抑制乳腺癌细胞的Akt信号通路而实现．本研究的结果揭示了CRM197在乳腺癌瘤治疗中的潜在价值，并为其应用于临床提供了实验依据．

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Theinhibitoryeffectsand mechanism of CRM197 on the migration and invasion of human breast cancer cells

LIANG Qiu⁃Shi1，HU Yi2
Shengjing Hospital of China Medical University：1Department of Ultrasound，2Department of Neurosurgery，Shenyang 110004，China

AIM：To investigate the effects of CRM197 on the migration，invasiveness，the activity of matrix metalloproteinase⁃2，9 as well as the expression of phosphorylated Akt of human glioma cells．METHODS：MDA⁃MB⁃231 human breast cancer cells were treated with 10 μg／mL CRM197 for 24 h．Cellular migration and invasiveness were assessed with Transwell assays．Zymography assay was performed to check the enzymatic activity of matrix metalloproteinase⁃2 and 9．Western blos assay was carried out to investigate the expression of phosphorylated Akt．RESULTS：Under the treatment of 10 μg／mL CRM197，the migration and invasion of MDA⁃MB⁃231 human breast cancer cells reduced significantly．The activity of matrix metalloproteinase⁃2／9 and expression of phosphorylated Akt were inhibited significantly as well．CONCLUSION：CRM197 possibly inhibite the migration and invasiveness of human glioma cells through inhibiting the activity of matrix metalloproteinase⁃2 and 9，and PI3K／Akt path⁃way may be involved in the process．

CRM197；breast cancer；invasion；migration；matrix metalloproteinase；Akt

R737．9

A

2095⁃6894（2017）02⁃26⁃04

2016－12－06；接受日期：2016－12－20

国家自然科学基金（81302191）

梁秋实．E⁃mail：18940259861＠163．com

胡 宜．副主任医师，副教授．E⁃mail：hooyie＠hotmail．com