时空表达可控性E2F3a转基因小鼠模型的建立

王程远，张 海，焦 勇，张 波（第四军医大学：唐都医院泌尿外科，实验动物中心，陕西西安70038）

时空表达可控性E2F3a转基因小鼠模型的建立

王程远1，张 海2，焦 勇1，张 波1（第四军医大学：1唐都医院泌尿外科，2实验动物中心，陕西西安710038）

目的：通过观察时空表达可控性E2F3a转基因小鼠模型，探讨建立膀胱癌动物模型的合适方法．方法：培育转基因动物品系，利用组织特异性启动子UropakinⅡ确保转基因表达的空间专一性，利用Doxycycline诱导系统实现转基因表达时间上的调控．结果：经杂交后筛选出阳性纯合子，能可控性地在膀胱组织中表达目的基因E2F3a．结论：利用组织特异性启动子UropakinⅡ和Doxycycline诱导表达系统，可以建立时空表达可控性E2F3a转基因小鼠模型．

转基因；模型；动物；肿瘤

0 引言

基因修饰动物模型是目前生命科学领域集成度最高的综合性研究体系之一，转基因动物模型是建立基因修饰动物模型的重要方法，在肿瘤研究方面应用广泛．通过实验手段将设计的目的基因导入到动物胚胎细胞中，随机整合入基因组，进入生殖细胞并稳定遗传至下一代，由此获得转基因动物．1980年，Gordon等［1］首次报道采用显微注射法将外源性DNA注入到受精卵的雄原核，再将受精卵移植至假孕鼠输卵管，从所得新生小鼠中筛选出整合有外源性基因的小鼠，成功建立显微注射法制备转基因动物的方法．

膀胱癌是泌尿生殖系常见肿瘤，其生物学行为具有高度异质性及不可预测性，复发率高，临床诊治棘手，深入探讨膀胱癌发生的分子生物学机制进而创制治疗膀胱癌新型药物已成为膀胱癌研究热点．膀胱癌的发生、发展与细胞周期失控密切相关．E2F转录调节因子是一组在细胞周期调控过程中起重要作用的调控蛋白，其中E2F3基因的表达与膀胱癌分期、分级、增殖有关［2］，E2F3存在E2F3a及E2F3b两种亚型，在细胞周期G1／S期过渡中起着关键作用［3］．

虽然膀胱肿瘤转基因小鼠模型在近十年中已有所发展，但是，目前不论是在模型种类还是在与人类疾病的拟合程度上，膀胱癌模型都远远落后于其他恶性实体肿瘤模型［4－5］．由于膀胱癌具有由表浅型向浸润型、由低级别向高级别转化的过程和现象，而E2F3基因的表达与膀胱癌分期、分级、增殖有关，所以建立具有膀胱上皮组织特异性、时间可控性的E2F3小鼠膀胱癌模型对膀胱癌研究具有重要意义．

1 材料和方法

1．1 材料实验涉及的主要材料：FVB／N小鼠、teto⁃Histone⁃GFP小鼠系购自美国JAX实验室．限制性内切酶购自美国Fermentas公司．DNA凝胶提取试剂盒购自美国Qiagen公司．PCR产物纯化试剂盒购自美国Amresco公司．

1．2 方法

1．2．1 供体雌鼠和假孕受体母鼠同步获得 供体FVB／N雌鼠通过注射激素的雌鼠与正常雄鼠交配而得，假孕受体母鼠通过正常FVB／N雌鼠与结扎FVB／N雄鼠交配产生．

1．2．2 受精卵的采集 供体FVB／N鼠注射孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）后，通过输卵管壶腹部收集受精卵细胞．透明质酸酶消化后备用．

1．2．3 重组质粒的制备 采用RT⁃PCR法合成E2F3a cDNA，E2F3a 基 因 引 物 序 列：F primer：TGGGCTGAGTCTGTCTGAGGA，R primer：GTTGAAGC⁃CAAGTCTTTGGAAG，产物长度 422 bp．将 E2F3a cDNA克隆入载体pTet⁃on（Clontech，Mountain View，CA）构建重组载体TRE⁃E2F3acDNA⁃SV40polyA（图1A）．为了增强E2F3a的表达，以pRL荧光素酶报告基因为载体骨架（Promega，WⅠ，USA）扩增一段嵌合内显子插入到上述的载体中．该内显子由源于人类β球蛋白基因第一段内含子的5'剪切位点和源于免疫球蛋白基因重链可变区基因内含子的3'剪切位点所组成．为了检测外源性E2F3a在转基因小鼠中的表达，将3XFLAG分子标记物克隆至E2F3a cDNA 5'端（图1B），XhoⅠ酶切此克隆载体且DNA凝胶纯化，回收线性化的DNA片段teto：intron：FAG：E2F3a：SV40polyA并进行纯化．以缓冲液调整目的DNA的浓度在5～10 ng／μL．

图1 UPⅡ⁃rtTA，teto⁃E2F3a转基因小鼠载体的构建

1．2．4 受精卵细胞显微注射及移植 纯化后5～10 ng／μL的DNA通过显微注射仪注射到FVB／N近交系受精卵细胞的原核中，注射后的受精卵细胞移植到受体动物ICR小鼠输卵管．受精卵细胞显微注射及移植操作步骤为：①置凹玻片于显微镜下，低倍聚焦．②调节持卵管，注射针与受精卵在同一视野下后，转换到高倍镜（32X）下时位置稍微低于受精卵，以便自如地操作受精卵．③挨近注射针到工作液或油界边缘，稍微进入油界．在注射前，增加注射针的压力可见DNA溶液泡在油内形成囊状，以此确定DNA溶液流存在．如果未见DNA溶液流，则轻轻摩擦持样器钝缘，渐渐打开注射器针头．针头重新进入油内确定DNA溶液流的存在．④移动持卵管回到受精卵下部，通过微分驱动水压控制系统使持卵管内产生温和的负压，并使持卵管末端吸住受精卵．⑤对持卵管内真空进行缓慢调节，使持卵管内受精卵轻柔地旋转，使卵内原核位于持卵管口的远侧端．⑥维持持卵管稳定，使注射针的针头紧靠受精卵的透明带，进行调节并使针与原核处于同一平面上．用注射针依次刺破透明带、细胞外膜、前核核膜，进入核膜内，受精卵的透明带易被针尖刺破，前核核膜相当有弹性，应用不同的方法进行尝试突破此结构．操作时避免与核接触损伤核仁．⑦保持注射针位置固定，轻轻增加压力使DNA溶液流入原核中．⑧用持卵器移动受精卵到凹玻片凹内相对隔离的位置，以区分注射组与非注射组．⑨将存活受精卵移植到同步交配的假孕母鼠的输卵管（或子宫）内，饲养后鉴定是否受孕以及个体发育状况．

1．2．5 子代鼠外源基因整合和表达的检测 转基因的基因组结合将通过PCR进行第一轮评估，第二轮评估将运用 E2F3a外显子 7序列作为探针进行Southern blotting以对E2F3a转基因拷贝数和基因组结合位点数作进一步分析（图1）．

Southern blotting：小鼠的基因组DNA将由其尾巴活检中提取．利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶NcoⅠ消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜上，经紫外线照射固定，再与定位于3．6 kb小鼠UPⅡ启动子的3'末端的450⁃bp磷32同位素标记的探针杂交（理论上会在胶片上得到两条带．切割后含有UPⅡ操纵子的外源DNA的长度应为1．6 kb，切割后含有内源UPⅡ操纵子的DNA长度应为5．4 kb）．用放射自显影显色，两条带的强度都将由ImageJ软件（NIH，USA）进行定量分析．转基因的拷贝数将由外源及内源基因两条带的强度对比确定．通过BamHⅠ酶切小鼠基因组DNA以确定转基因是否被整合在基因组的唯一位点上．

依照上述同样的实验步骤，利用XhoⅠ和HindⅢ双酶切从teto⁃E2F3a小鼠系中提取的DNA．由PCR扩增E2F3a第七外显子并用同位素标记作为探针进行杂交．如果小鼠转基因成功，理论上会在胶片上看到长度为5．6 kb含E2F3a基因的内源性片段，和1．6 kb含有转基因E2F3a外源片段．如同上述，转基因整合位点的数量将由限制性切酶XbaⅠ消化所得的DNA片段和E2F3a第七外显子同位素标记的探针杂交确定（图1）．

1．2．6 转基因小鼠品系的建立 初代首建小鼠将与纯种FVB／N小鼠杂交以测试转基因是否可被传给下一代．由初代可通过遗传传递的teto⁃E2F3a F1小鼠将与用ptTA2⁃4载体（Clontech）通过前述方法建立的转基因UPII⁃rtTA系小鼠杂交．UPII⁃rtTA F1阳性的转基因小鼠将与teto⁃Histone⁃GFP小鼠系杂交（JAX lab，USA）．将喂食含有Doxycycline（Doxycycline的作用是其必须与rtTA共同结合在teto操纵子上才可诱导teto下游克隆基因的表达）食物1，2月后的UPII⁃rtTA；teto⁃Histone⁃GFP小鼠按照实验常规摘取所有组织和器官．摘取的组织和器官将即刻冷冻于液氮并包埋于OCT介质中．冷冻样本切片后，通过Zeiss荧光显微镜检测GFP在各组织中的表达以评估UPII⁃rtTA是否成功诱导的转基因表达以及转基因表达是否具有组织特异性．

2 结果

2．1 转基因小鼠基因表型鉴定用特异引物对teto⁃E2F3a转基因小鼠的基因组进行PCR扩增，发现6、10、11小鼠可扩增出大小约420 bp的条带，与预期大小相符，表明获得3只阳性首建鼠（图2）．

图2 teto⁃E2F3a转基因小鼠基因表型分析（M为 marker，1～15为F0小鼠，N为阴性对照，P为阳性对照，H为空白对照）

2．2 荧光显微镜检测GFP在膀胱组织中的表达

应用Zeiss荧光显微镜检测GFP在F1代膀胱组织中的表达可见UPII⁃rtTA成功诱导E2F3a基因表达（图3）．

图3 荧光显微镜检测F1代GFP在膀胱组织中的表达

2．3 teto⁃E2F3a基因表达的分析用Western Blot方法对其中2只首建鼠F1代及野生型小鼠、同窝阴性对照小鼠膀胱组织中E2F3a蛋白表达进行比较分析，发现2只首建鼠F1代膀胱组织中E2F3a蛋白表达明显高于其他小鼠（图4）．

图4 膀胱组织中E2F3a蛋白表达（1为野生型对照小鼠；2，3为首建鼠 F1代；4，5为同窝阴性对照小鼠 β⁃actin43kDa E2F3a58kDa）

用Western Blot方法对其中1只首建鼠F1代肝、肾、膀胱、心脏、胃、脾脏、肺、骨骼肌组织中E2F3a蛋白表达进行比较，可见膀胱组织中表达明显高于自身其他组织（图5）．

图5 F1代自身组织中E2F3a蛋白表达（1为肝、2为肾、3为膀胱、4为心脏、5为胃、6为脾脏、7位肺、8为骨骼肌 β⁃ac⁃tin43kDa E2F3a58kDa）

2．4 Doxycycline诱导表达系统与E2F3a蛋白表达

对转基因小鼠按每日0．5g／kg剂量喂饲Doxycyc⁃line，作为正常对照（normal N），不喂饲 Doxycycline作为阴性对照，其余按1g／kg剂量喂饲Doxycycline作为实验组，在喂饲1月、2月分别用Western Blot方法观察E2F3a蛋白在膀胱中的表达，并进行对比分析，发现Doxycycline诱导表达系统可诱导E2F3a蛋白表达，E2F3a蛋白表达差异与Doxycycline喂饲量及喂饲时间相关（图6、7），可见在适当的Doxycycline喂饲量下，能够实现 Doxycycline诱导表达系统对E2F3a蛋白表达时间上的人为理想控制．

3 讨论

基因修饰动物模型是人类疾病重要的动物模型，在认识基因功能、制作人类疾病动物模型、开展新药评估、生产药用蛋白等研发领域中具有重要支撑作用．建立肿瘤相关转基因动物模型，目前是肿瘤研究热点之一．膀胱癌是泌尿系统常见肿瘤，其发病率位居全身恶性肿瘤第6位，在我国泌尿系统肿瘤中，无论发病率或病死率膀胱癌均占首位［6］．由于膀胱癌的生物学行为具有很强异质性及不可预测性，易发生浸润转移，复发率高，临床诊治棘手［7］．阻止浸润性膀胱癌的发生以及由低级别表浅型向高级别浸润型恶性转变过程是膀胱癌研究的重点．E2F3基因属于E2F家族，定位于人体染色体6p22区域．既往研究发现在膀胱肿瘤中E2F3过表达，而且大约1／3浸润性膀胱肿瘤的细胞浸润早期阶段就发现有E2F3过表达现象［8－9］．笔者在膀胱癌研究中观察到E2F3的过表达，并且E2F3的高表达与浸润性膀胱分级、分期相关［10］．膀胱癌以往的研究结果多为来自肿瘤细胞系、肿瘤组织标本等的静态研究，由于体外和体内基因功能研究尚存在一定差异，体外基因功能研究往往不能够完全模拟基因在体作用形式和机制，因此，建立表达或缺失特异目的基因的遗传工程小鼠（geneti⁃cally modified mice，GMMs），整体动态观察目的基因功能，是研究人类疾病发病机制、解答特定人群对某种疾病的易感性、识别药靶、新药筛选和疗效判定等有效的手段．

图6 喂饲Doxycycline 1月E2F3a蛋白在小鼠膀胱中的表达

图7 喂饲Doxycycline 2月E2F3a蛋白在小鼠膀胱中的表达

小鼠uroplakinⅡ基因上游一段3．6 kb长的序列可引导癌基因在尿道上皮的特异性表达，通过膀胱上皮组织特异性uroplakinⅡ启动子驱动位于第12密码子突变的H⁃RAS等位基因而实现［11－12］．uroplakinⅡ启动子可以特异性启动SV40大T细胞抗原的表达，使p53和RB蛋白失活，导致小鼠产生膀胱CIS病变［13］．之后这些肿瘤进展成为侵袭性和转移性的病变，且在组织病理学和分子生物学改变上与人类晚期膀胱癌类似．将该序列与诱导癌蛋白基因SV40T整合后构建出UPⅡ⁃SV40T嵌合基因，转染小鼠可导致膀胱癌产生．四环素诱导表达系统是一种由tetra⁃cycline（tet）或四环素衍生物Doxycycline（Dox）参与调控的外源基因可控性表达体系，根据四环素操纵子的负调控原理，利用大肠埃希菌抗四环素操纵子的阻遏与去阻遏作用调控基因表达．由于该调控系统的调控原件源自原核生物，其调控元件不是真核细胞内源性的，和金属离子诱导表达系统、热激素低氧细胞因子等内源性的真核诱导表达系统相比，被诱导时不会影响真核细胞除目的基因之外的其他基因表达，并能实现基因表达时间上的人为控制，在研究特定基因与基因相关疾病动态关系方面优势明显［14］．活体成像技术采用荧光报告基团进行标记，研究者可动态观察活体内特定基因表达的生物学过程，观察肿瘤生长及转移．绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是常见的荧光报告基团之一，是从水母体内提取出来的具有荧光性质的蛋白质，荧光性质稳定，在转基因动物体内表达后不影响动物自身生物学特性，所得图像资料客观、及时、准确，较之组织化学方法受外界因素干扰小，在肿瘤研究中有重要价值．本实验中E2F3a基因组织特异性表达通过组织特异性启动子UropakinⅡ来实现，时间可控性通过喂食药物Doxycycline来控制，并对E2F3a基因进行绿色荧光蛋白基团标记．建模成功后，可以在特定条件下观察致癌因素在活体水平与膀胱癌发生、发展、恶化、转移等疾病过程的关系，具有动态性、整体性、组织特异性、时间可控性等特点，便于筛选致癌因素和膀胱癌的相互关系．

尽管膀胱癌发生发展中一些十分重要的分子遗传学因素已经得到了确认，但是目前膀胱癌发病机制的研究最大局限在于未能在活体内确认究竟是哪些遗传学因素作用于膀胱肿瘤发生发展之中［15］．由于膀胱癌具有由表浅型向浸润型、由低级别向高级别转化的过程和现象，所以建立时间可控性、组织特异性小鼠膀胱癌模型对膀胱癌研究具有重要意义．运用具有组织特异性以及时间可控的方式诱导癌基因在特定组织表达，与人类疾病发展真实过程拟合度较高，为研究基因与基因相关疾病的动态关系创造了有利条件，在基因功能、疾病机理研究、药效评价、药物生产、治疗靶点选择等方面具有指导意义．

［1］Gordon JW，Scangos GA，Plotkin DJ，et al．Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，1980，77（12）：7380－7384．

［2］Johnson JL，Pillai S，Pernazza D，et al．Regulation of matrix metal⁃loproteinase genes by E2F transcription factors：Rb⁃Raf⁃1 interaction as a novel target for metastatic disease［J］．Cancer Res，2012，72（2）：516－526．

［3］Tsai SY，Opavsky R，Sharma N，et al．Mouse development with a single E2F activator［J］．Nature，2008，454（7208）：1137－1141．

［4］Lin⁃Tsai O，Taylor JR，Clark PE，et al．Progress made in the use of animal models for the study of high⁃risk，nonmuscle invasive bladder cancer［J］．Curr Opin Urol，2014，24（5）：512－516．

［5］Tachibana H，Gi M，Kato M，et al．Carbonic anhydrase 2 is a novel invasion⁃associated factor in urinary bladder cancers［J］．Cancer Sci，2016．

［6］Colli J，Sartor O，Thomas R，et al．Does urological cancer mortality increase with low population density of physicians［J］．J Urol，2011，186（6）：2342－2346．

［7］Sievert KD，Amend B，Nagele U，et al．Economic aspects of bladder cancer：what are the benefits and costs［J］．World J Urol，2009，27（3）：295－300．

［8］Oeggerli M，Schraml P，Ruiz C，et al．E2F3 is the main target gene of the 6p22 amplicon with high specificity for human bladder cancer［J］．Oncogene，2006，25（49）：6538－6543．

［9］Zhang Y，Zhang Z，Li Z，et al．MicroRNA⁃497 inhibits the prolifer⁃ation，migration and invasion of human bladder transitional cell carcinoma cells by targeting E2F3［J］．Oncol Rep，2016，36（3）：1293－1300．

［10］焦 勇，张 波，李瑞晓，等．E2F3在浸润性膀胱癌中的表达关系以及对患者生存的影响［J］．中国医师杂志，2016，18（1）：29－32．

［11］Mcconkey DJ，Lee S，Choi W，et al．Molecular genetics of bladder cancer：Emerging mechanisms of tumor initiation and progression［J］．Urol Oncol，2010，28（4）：429－440．

［12］Mo L，Zheng X，Huang HY，et al．Hyperactivation of Ha⁃ras oncogene，but not Ink4a／Arf deficiency，triggers bladder tumorigenesis［J］．J Clin Invest，2007，117（2）：314－325．

［13］Zhang ZT，Pak J，Shapiro E，et al．Urothelium⁃specific expression of an oncogene in transgenic mice induced the formation of carcinoma in situ and invasive transitional cell carcinoma［J］．Cancer Res，1999，59（14）：3512－3517．

［14］Shockett PE，Schatz DG．Diverse strategies for tetracycline⁃regulated inducible gene expression［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，1996，93（11）：5173－5176．

［15］Pollard C，Smith SC，Theodorescu D．Molecular genesis of non⁃mus⁃cle⁃invasive urothelial carcinoma（NMIUC）［J］．Expert Rev Mol Med，2010，12：e10．

Establishment of transgenic mouse models by controlling temporal and spatial expression of E2F3a

WANG Cheng⁃Yuan1，ZHANG Hai2，JIAO Yong1，ZHANG Bo1Fourth Military Medical University：1Department of Urology，Tangdu Hospital，2Laboratory Animal Center，Xi'an 710038，Shanxi Province，China

AIM：To study the dynamic processes of transgenic mouse models by controlling temporal and spatial expression of E2F3a，discuss how to establish an appropriate animal model of bladder cancer．METHODS：The binary transgenic mouse models were constructed．One was a spatial⁃specific promoter，and the other was an artificially controlled temporal expressing model using Doxycycline system．RESULTS：The binary transgenic mouse was produced by crossing with transgenic mouse，and an induced expression of E2F3a in bladder cells can be controlled by administering with Doxycycline．CONCLUSION：Temporal and spatial expression of E2F3a in bladder cells can be controlled artificially by using UropakinⅡpromoter and Doxycycline system，the mouse model has been successfully established in this study．

transgenic；model；animal；cancer

Q78

A

2095⁃6894（2017）02⁃21⁃05

2017－01－06；接受日期：2017－01－20

国家自然科学基金（31272391）

王程远．硕士．研究方向：泌尿系肿瘤基础与临床．E⁃mail：chengyuandoctor＠163．com

张 波．副主任医师，副教授．Tel：029⁃84777728 E⁃mail：zhangbo＠fmmu．edu．cn