抗体放散试验在直接抗人球蛋白试验阳性患者中的应用

别立莉，梁会涛，安慧娟

(河南省红十字血液中心，河南郑州450012)

抗体放散试验在直接抗人球蛋白试验阳性患者中的应用

别立莉，梁会涛，安慧娟

(河南省红十字血液中心，河南郑州450012)

目的探讨抗体放散试验在直接抗人球蛋白试验（DAT）阳性患者输血前实验室检查中的意义，为临床输血安全提供保障。方法通过回顾性分析74例患者的DAT阳性强弱度、放散液和血清中抗体特异性比较、经稀释后的放散液中的抗体特异性，探讨放散试验在输血前检查中的应用。结果74例DAT阳性反应强弱度为：W+（13.5%），1+（31.1%），2+（32. 4%），3+（16.2%），4+（6.8%）；放散后抗体鉴定32例为阴性，16例放散液检测到特异性同种抗体，和患者血清中的一致，并且所有患者均有输血史；26例放散液为全凝集，进行了稀释，其中4例检测到了同种抗体。结论抗体放散试验在输血前检查中并为常规试验，但对于DAT阳性的患者来说进行放散试验是很有必要的。

DAT；输血前检查；放散试验；同种抗体；抗体效价

直接抗人球蛋白试验（DAT）是用于检测红细胞是否被不完全抗体或补体所致敏。通过对红细胞进行放散试验，能检测出包被在红细胞上IgG抗体的特异性。有文献[1]指出献血者中1：14000至1：1000的人和1%~15%的住院患者DAT试验会为阳性，但是并不一定发生免疫介导的红细胞破坏。抗体放散试验根据抗原抗体反应可逆的原理，将红细胞表面的抗体释放出来，再通过对放散液进行抗体鉴定来明确是什么样的抗体导致患者DAT阳性。现对DAT阳性患者采集样本进行放散和抗体检测，以探讨输血前检查中DAT和放散试验的必要性。

1 材料与方法

1.1 研究对象2012年1月至2015年12月郑州地区各级医院送检并经检测DAT为阳性的患者样本74例。

1.2 试剂仪器KA-2200小型台式血型血清学离心机（日本久保田公司）；抗-IgG+C3d、抗-IgG、抗-C3d、抗-M、抗-P（均为上海血液生物医药有限公司产品）；抗-E、抗-e、抗-C、抗-c(美国Immucor公司产品)；抗体鉴定16系谱细胞（荷兰Sanquin公司产品）；6%白蛋白、IgG致敏红细胞、酸放散试剂盒（长春博德生物技术有限责任公司产品）。

1.3 直接抗人球蛋白试验（试管法）[2]将EDTA抗凝的血液样本用生理盐水洗涤3次后配置成3%的红细胞悬液，取2支干净试管，分别标记为测定管和对照管，向2支试管中分别加入1滴3%的红细胞悬液，再向测定管中加入抗人球蛋白试剂（AHG）1滴，向对照管中加入6%白蛋白1滴，混匀，1000×g离心15s，观察凝集情况，评分并记录结果。立即离心测定管出现凝集，而6%白蛋白对照管未出现凝集，直接抗球蛋白试验（DAT）阳性，并根据凝集强弱度评分。如果6%白蛋白对照管在离心后出现凝集，则实验结果无效。如果试验过程中未观察到凝集，加入IgG致敏红细胞后发生凝集，则DAT为阴性。如果IgG致敏红细胞不凝集，阴性结果无效，需重复实验。

1.4 抗体酸放散试验[2]取DAT阳性待检血样，离心弃去血清或血浆，用生理盐水洗涤4次，留取约1ml的最后洗涤液，将1ml的待检压积红细胞与1ml酸放散液混合均匀，室温孵育1~2min，3000r/ min离心1min，立即将放散液移至另一支干净试管，加入中和液调至pH值为近中性。

1.5 抗体鉴定试验取17支干净试管，分别标记为1~16号和自身对照，每管中先各加入2滴受检者血清或放散液，再分别加入1滴对应的3%的1~ 16号谱细胞和自身对照红细胞悬液，混匀后1000×g离心15s，观察凝集情况，评分并记录结果，根据谱细胞格局表判断抗体特异性。37℃孵育30min。1000×g离心15s，观察溶血和凝集情况，评分并记录结果，生理盐水洗涤红细胞3次，最后一次洗涤尽量移除上清，向红细胞扣里加入抗人球蛋白试剂（AHG）1滴，充分混匀。1000×g离心15s。观察溶血和凝集情况，评分并记录结果。加入IgG致敏的试剂红细胞确认阴性结果的有效性。根据谱细胞格局表判断抗体特异性。

2 结果

2.1 DAT阳性强弱度特性和放散液检测结果74例DAT阳性反应凝集强弱度评分结果：W+（2分）为13.5%；1+（5分）31.1%；2+（8分）32.4%；3+（10分）16.2%；4+（12分）6.8%。见表2。

表1 74例DAT阳性凝集强弱度和放散液抗体鉴定结果

表2 放散液中的抗体和血清中的抗体特异性比较

表3 稀释后的放散液和血清中的抗体特异性比较

2.2 患者放散液和血清的抗体特异性比较74例患者进行抗体放散试验，放散液进行抗体鉴定，32例为阴性，26例全凝集，16例在放散液中检测到抗体特异性，并且在患者的血清中也存在这些抗体见表3。所有16例患者均有输血史，DAT阳性强弱度为W+到2+见表2。

2.3 患者经稀释后的放散液和血清的抗体特异性比较26例放散液全凝集患者的DAT阳性强弱度为1+到4+见表2，所有放散液与试剂谱细胞均为全凝集。对这26例放散液用0.9%生理盐水进行1：1稀释，然后进行抗体鉴定。结果4例稀释后的放散液检测到抗体的特异性，并且有2例在血清中未检测到抗体特异性。见表4。

3 讨论

放散试验的目的是从致敏红细胞上释放抗体分子。放散方法的原理：⑴通过改变抗原抗体反应的热力学结构，⑵通过中和或扭转的力量破坏抗原抗体复合物，⑶通过破坏抗原抗体结合位置的结构。通常的目标是重新获得有活性的抗体[1]。常用的放散方法有热放散、乙醚放散、甘氨酸放散和二磷酸氯喹放散等。热放散通常仅用于因ABO不相合引起的HDFN的调查，因为这些方法对ABO系统以外的抗体放散效果不好；乙醚放散常用于Rh系统引起的HDFN的检测，但乙醚可导致红细胞的破坏；甘氨酸在移除IgG自身抗体和同种抗体的能力上显著优于其他方法，但对Kell系统的抗原几乎完全破坏；二磷酸氯喹放散对移除致敏红细胞上抗体是有效的，虽然没有甘氨酸和热放散移除的能力强，但是它可以使DAT阳性减弱[3-6]。因此需要根据不同的试验目的选择放散试验的方法，本研究选用移除IgG抗体能力优于其他方法的甘氨酸放散方法。

本研究对DAT阳性的凝集强弱程度与放散液检测结果做了分析（表2），发现16例放散液中有特异性抗体的患者，DAT凝集等级在W+至2+之间，Nathalang O等[7]的研究中对DAT阳性、放散液发现有抗体的21例患者进行DAT凝集强度统计也均在W+至2+之间，戴小波等[8]的研究结果中57例DAT阳性的非自身免疫性溶血性贫血患者的DAT凝集强弱度也在W+至2+之间，与本研究结果基本一致。

对74例DAT阳性患者进行抗体放散试验，并对放散液进行抗体特异性鉴定，32例为阴性，26例全凝集，16例在放散液中检测到抗体特异性，并且在患者的血清中也存在这些抗体，详见表3。26例患者经放散后，放散液与试剂谱细胞反应为全凝集，本研究又利用抗体稀释后能够将混合抗体分开，以有效的去除一种抗体以便检测另一种抗体这一原理，为了去除自身抗体或其他抗体的影响，用0.9%生理盐水进行稀释后，用试剂谱细胞再次检测，结果4例分别存在有抗-Ce、抗-E、抗-Ec和抗-Jka，这是因为患者这些抗体完全吸附到了红细胞表面，而自生抗体的存在又影响了这些抗体的检出，对放散液进行稀释后，这些抗体才得以被检测到。更有意义的是其中有2例放散液中发现的抗-Ec、抗-Jka（表4）在患者血清中并未检测到，这很可能是这两个抗体的数量较少，全部吸附到了患者的红细胞上，以至于血清中无法检测到，仅能通过放散试验检测到。Yazer MH[9]也有同样发现12.7%的样本在放散后发现了血清中没有检测到的抗体。

红细胞放散液中的特异性同种抗体多为免疫性抗体，其产生原因有：⑴受血者的血液中有同种抗体，与献血者红细胞上的抗原发生反应；⑵献血者的血浆、血浆衍生物以及红细胞制品有同种抗体，与受血者的抗原发生反应；四、母亲血液中同种抗体通过胎盘，包被在胎儿红细胞膜上；⑶器官移植和骨髓移植所产生的抗体等。目前输血规程中规定输血前检测仅包括ABO、Rh血型和交叉配血试验，DAT和抗体放散试验以及抗体筛选和抗体鉴定未列入内；而供血者常规检查包括ABO、Rh血型，未包括抗体筛选和抗体鉴定。当患者在输注血液制品时一旦交叉配血试验漏检或遇到弱的抗体，患者就有可能输入红细胞上抗原相对应的抗体或血浆中抗体相对应的抗原，导致DAT阳性而发生溶血反应。所以对患者和供血者进行抗体筛选和抗体鉴定是很有必要的[10]，而放散试验作为输血前常规检查可能是没有必要的，但对于有溶血性输血反应、自身溶血性贫血以及近期有过输血史和输血前检查中发现有抗体的DAT患者来说，进行放散试验还是非常有必要的。特别是当放散试验发现了血清中所没有检测到的抗体，在给患者输注红细胞制品时，就应避开这些相应的抗原，否则输血只会使患者的溶血反应加重。

[1]Leger RM.The positive antiglobulin test and immunemediated haemolysis[J].In：Roback JD，Combs MR，Grossman BJ，Hillyer CD，editors.Technical Manual 16th ed，Bethesda，MD：American Association of Blood Banks；2008：499-521.

[2]尚红，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程[M].第4版.北京：人民卫生出版社，2014：127-130.

[3]Katharia R.Removal of antibodies from red cells：Comparison of three elution methods[J].Asian Transfus Sci，2013，7(1)：29-32.

[4]李静，陈保民.4种放散方法解离免疫球蛋白G抗体效果比较[J].检验医学与临床，2015，12(13)：1947-1949.

[5]郑凌，刘衍春，吴敏慧，等.甘氨酸-HCl/EDTA酸放散法在AIHA标本配血中的应用[J].中国输血杂志，2013，26（10）：1005-1007.

[6]朱奕，薛俭成.抗体检测在自身免疫溶血性贫血患者中的应用[J].国际检验医学杂志，2007，28(1)：30-31.

[7]Nathalang O，Sriwanitchrak P，Tubrod J，et al.Antibody elutions in Thai patients with a positive direct antiglobulin test[J].Blood Transfus，2011，9：306-310.

[8]戴小波，任燕歌，曾朱君，等.直接抗人球蛋白试验阳性非自身免疫性溶血性贫血受血者的临床特征和输血对策[J].中国输血杂志，2013，26(6)：555-557.

[9]Yazer MH.The role of the elution in antibody investigations[J]. Transfusion，2009，49(11)：2395-9.

[10]李慧，徐焕铭，张毅，等.输血前患者不规则抗体筛查及鉴定结果分析[J].中国实验血液学杂志，2015，3（3）：861-865.

R457.1+3，R446.62

A

1674-1129(2017)02-0288-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.053

2016-11-02；

2017-01-03)