微小牛蜱唾液菌群的PCR-DGGE分析

向亮亮 ， 唐 欢 ， 程天印

(湖南农业大学动物医学院 ， 湖南长沙410128)

微小牛蜱唾液菌群的PCR-DGGE分析

向亮亮 ， 唐 欢 ， 程天印

(湖南农业大学动物医学院 ， 湖南长沙410128)

为了解微小牛蜱唾液内的菌群结构信息，采用PCR-DGGE技术对微小牛蜱半饱血、饱血雌成虫唾液内菌群结构进行了分析和比较，结果表明：微小牛蜱半饱血、饱血雌成虫唾液内菌群结构有较大差异，饱血中细菌比半饱血多两种，分别为莫拉菌和不动杆菌；唾液内菌群与全蜱菌群差异极大。在检出的细菌中多数具有一定的致病性，故微小牛蜱叮咬可能会引起人或动物发生多种细菌性疾病。

DGGE ； 微小牛蜱 ； 唾液 ； 细菌

微小牛蜱是我国的优势蜱种之一，广泛分布于澳洲、亚洲、非洲和美洲，我国的华北、华中、华东、华南和西南等地区也普遍存在，侵袭人和黄牛、水牛、牦牛、驴、马、山羊、绵羊、犬、猫等多种动物，是巴贝斯虫病、双芽巴贝西虫病、北亚蜱媒斑疹伤寒、莱姆病、Q热等疾病的传播媒介，其中唾液传播是其最主要的方式[1]，但迄今为止仅Budachetri对海湾花蜱的唾液菌群结构进行了分析[2]，至于其唾液中含有哪些细菌国内外尚未见报道。DGGE-PCR技术是一种用于检测DNA突变的电泳技术，能够将长度相同但序列不同的DNA片段分离开来。本研究采用PCR-DGGE技术分析微小牛蜱唾液的菌群结构，旨在了解微小牛蜱唾液在疾病传播方面的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 微小牛蜱 采自湖南农业大学郊区黄牛，光学显微镜下经形态学鉴定为微小牛蜱。

1.1.2 主要试剂及仪器 细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；2×EasyTaqPCR Super Mix，购自北京全式金生物技术有限公司；pEASY-T1 Cloning Kit试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司；DGGE变性梯度凝胶电泳仪(DGGEK-2001)，购自CBS公司。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集 取半饱血、饱血雌成微小牛蜱(雌、成虫)若干只，按照廖芷卉[3]等人介绍的方法分别采集唾液。虫体于液氮中研磨成粉，加适量灭菌生理盐水，制成悬液，于400 r/min离心5 min，上清液备用。

取全蜱悬液和唾液各30 μL，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书操作，提取细菌DNA。

1.2.2 细菌16S rDNA V3 区扩增 以全蜱或唾液细菌总DNA为模板、341F(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和907R(5′-CCCCGTCAATTCATTTGAGTTT-3′)为引物分别扩增各样品。以上述扩增产物为模版341F-GC(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCCGGGGGGCCTACGGGAG-GCAGCAG-3′)和518R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)为引物进行第二轮扩增，制备全蜱、唾液细菌16S rDNA V3区。反应体系(50.00 μL)为：模板 0.50 μL，上、下游引物(10.00 μmol/L)各1.00 μL，EasyTaq mixture 25.00 μL，ddH2O 22.50 μL，PCR反应条件参照Schabereiter-Gurtner的方法[4]进行。产物5.00 μL于1.5%琼脂糖凝胶中电泳。

1.2.3 细菌16S rDNA V3 片段DGGE电泳 按30%～60%变性剂浓度梯度制备6%聚丙烯酰胺凝胶胶(40%去离子甲酰胺和7.00 mL/L尿素为100%变性剂)；移半饱血、饱血全蜱及其唾液细菌16S rDNA V3区扩增产物各10.00 μL至点样孔；电泳条件为：60 ℃，170 V，电泳16.5 h。EB染色20 min，观察结果。以Quantity One4.6.2绘制DGGE电泳谱示意图、展示其差异性。

1.2.4 片段回收、克隆、测序及其分析 切取DGGE胶中的各明亮、清晰的条带；洗涤后以DNA片段快速纯化回收试剂盒纯化。产物与pEasy-T1载体连接，转化E.coliTrans1-T1感受态细胞，选择阳性克隆，送深圳华大基因科技服务有限公司测序。

上传所得序列，BLAST比对，收集最为相近的序列。

2 结果与讨论

2.1 16S rDNA V3区扩增片段 样品经两轮PCR扩增，所得16S rDNA V3 区片段大小约200 bp，与预计相符(图1)。

图1 四样品细菌16S rDNA V3区扩增片段

M：Marker； 1：半饱血全蜱； 2：半饱血蜱唾液； 3：饱血全蜱； 4：饱血蜱唾液； N：空白对照

2.2 细菌16S rDNA V3区DGGE电泳结果分析 DGGE电泳结果显示：半饱血、饱血微小牛蜱(雌、成虫)唾液菌群结构差异较大，其中饱血蜱唾液含优势菌14种，半饱血微小牛蜱(雌、成虫)唾液仅有12种。半饱血、饱血微小牛蜱(雌、成虫)全蜱优势菌相似，但不同菌种的丰度有些许的差异；无论在半饱血蜱、还是饱血蜱，其唾液的菌群结构均与全蜱有极大的不同，见图2。

图2 四样品细菌16S rDNA V3区扩增片段DGGE电泳图

Wb：半饱血全蜱； Tb：半饱血蜱唾液； WB：饱血全蜱； TB：饱血蜱唾液； N：阴性对照

2.3 优势条带序列比对结果与分析 本试验从DGGE胶中采集条带14个，各片段DNA序列比对结果如表1。

表1 DGGE回收条带序列比对结果

在检出的14种菌中，除皮氏立克次体、不可培养的γ变形菌和拟杆菌外，其他11种菌类均已有致人发病的报道，暗示微小牛蜱有较大的潜在传病风险。在检出的细菌中，皮氏立克次体已在微小牛蜱[5]和安氏革蜱检出[6]，故笔者支持Niebylski[7]的看法。Niebylski认为皮氏立克次体为蜱虫胞内共生菌，对蜱虫的生长和发育有着重要作用。

就全蜱而言，半饱血雌成蜱的优势菌种类较饱血的更多，与Heise[8]等的研究结果一致。陈小玲[9]等认为，蜱类中肠免疫可分泌多种抗菌物质，能抑杀体内部分细菌，以致吸血过程中蜱内细菌常有先增后减的现象。与之相反，半饱血雌成蜱唾液内优势菌种类较饱血雌成蜱唾液内的少，这可能与不同细菌的繁殖速度有关。Reif[10]、Kocan[11]和侯雨丰[12]等人的研究表明，一些细菌如土拉弗朗西斯菌、边缘无形体和立克次体均能在蜱虫唾液腺生长发育，但不同细菌繁殖的速度不同，如大肠杆菌繁殖一代仅需15～30min[13]，而立克次体却长达9～12 h[14]。

无论在饱血中还是在半饱血中，唾液内细菌种类均较全蜱为多，这可能与菌类在蜱体内的发育部位和本试验所采用的检测方法有关。Silva和Fikrig[15]证实，一些细菌在蜱虫中肠定居，在唾液腺繁殖、发育，而后排至唾液。这些细菌在唾液中的相对含量较高，在全蜱中相对含量不一定很高。PCR-DGGE技术无法检出低于1%的类群[16]，故以唾液为样品检出的细菌，在全蜱样中不一定能检出。

由于DGGE技术的局限性，本研究获得的仅是唾液内部分菌种信息，至于唾液和蜱虫所带菌的详情，则需更加精密的手段，如高通量技术。

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DGGE identification ofmicroflorain the saliva fromRhipicephalusmicroplus

XIANG Liang-liang , TANG Huan , CHENG Tian-yin

(College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

To study bacterial communities present in saliva ofRhipicephalusmicroplus(B.microplus). The bacteria in saliva which was collected from partially engorged female adult ticks or fully engorged female adult ticks were analysed with the denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE). It showed that the microbial number and population structure in the saliva from the fully engorged ticks were more different than that from the partially engorged. Fully engorged tick more than partially engorged about two species of bacteria.They Were affiliated withMoraxellaceaebacterium andAcinetobactercalcoaceticusMicrobial in saliva from ticks significantly differed from that in their whole body,and no matter they were partially engorged or fully engorged. Most of bacteria detected in this study were known to be pathogenic.Thus the individual is bitten by theRhipicephalusmicroplusmight develop multiple bacteria disease.

DGGE ;Rhipicephalusmicroplus; saliva ; bacteria Corresponding author：CHENG Tian-yin

2016-03-04

国家自然科学基金(31372431)

向亮亮(1989-)，男，硕士，主要从事蜱及蜱传病研究，E-mail:liangliangxiang@hotmail.com

程天印，E-mail:hn5368@163.com

S852.7

A

0529-6005(2017)03-0003-03