三重荧光PCR检测食源性致病菌方法的建立与初步应用

谢海燕 ， 蔡奕琪 ， 张端秀 ， 徐振娜 ， 洪伟彬

(东莞市动物疫病预防控制中心，广东东莞 523086)

三重荧光PCR检测食源性致病菌方法的建立与初步应用

谢海燕 ， 蔡奕琪 ， 张端秀 ， 徐振娜 ， 洪伟彬

(东莞市动物疫病预防控制中心，广东东莞 523086)

根据大肠杆菌 O157的rfbE基因、志贺肠杆菌ipaH基因、单增李斯特杆菌hlyA基因的保守序列，设计引物和探针，通过优化反应体系，测定其灵敏度、特异性和重复性，建立了可同时检测上述3种食源性致病菌的多重实时荧光PCR方法。试验结果显示，该方法对大肠杆菌O157、志贺肠杆菌、单增李斯特杆菌进行3联扩增的相对灵敏度检测限分别为5×102、5×102和5×103CFU/mL；对10株标准/参考菌株的检测结果，只有目的菌株呈阳性反应；用该方法检测26份冻肉样品，与传统的细菌分离鉴定法结果一致，说明研究建立的方法是鉴定3种食源性致病菌的有效方法。

大肠杆菌 O157 ； 志贺氏肠杆菌 ； 单增李斯特杆菌 ； 三重荧光PCR ； 方法建立 ； 初步应用

在我国食源性细菌污染严重，统计资料表明，我国在1992—2001 年间发生的食物中毒病例中， 细菌性食物中毒所占比例高达50.9%。人兽共患致病菌已成为重要的公共卫生问题。而大肠杆菌O157、志贺肠杆菌、单增李斯特杆菌是国内重要而常见的食源性人兽共患致病菌。这3种人兽共患致病菌危害严重，会对畜牧业、出口等造成重大的经济损失，也会通过污染的动物源性食品感染人类，导致食物中毒、败血症、尿毒症等，严重时可导致死亡。目前，国内外检测这3种致病菌方法很多，有胶体金免疫层析检测试纸条方法[1]、酶联免疫吸附法[2]、免疫磁珠法[3-4]、环介导等温扩增技术[5-6]、聚合酶链式反应(PCR)技术[7]、基因芯片技术[8]等，但这些方法都不能同时具备快速、特异、灵敏、经济、简便等优点而未得到推广。

为了建立一种简便、敏感、准确可靠的快速检测方法，通过反复试验，建立了大肠杆菌O157、志贺肠杆菌、单增李斯特杆菌三重荧光PCR检测方法，适用于大批量的样本检测、突发疫情诊断和食品安全检测，对公共安全具有较大的意义。

1 材料

1.1 试剂与耗材 DNA提取试剂盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit，由美国OMEGA公司生产； real time PCR试剂，由宝生物工程(大连)有限公司生产。

1.2 主要仪器 7500 Real Time PCR System，美国Applied Biosystems公司生产；Sigma 3-18 K小型高速冰冻台式离心机，德国Sartorius公司生产；NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer 紫外分光光度计，美国 NanoDrop Technologies 公司生产。

1.3 菌种 大肠杆菌O157:H7(CICC21530)、志贺肠杆菌(CICC21534)、单增李斯特杆菌(CICC21633)、沙门菌(CICC21513)标准菌株由中国工业微生物菌种保藏中心提供；金黄色葡萄球菌、致病性链球菌、空肠弯曲菌、副溶血性弧菌、普通变形杆菌、铜绿假单胞杆菌等菌株由珠海出入境检验检疫局动物检验检疫实验室提供。

表1 3种致病菌的引物和探针序列

2 方法

2.1 引物、探针的设计与合成 根据GenBank中公布的大肠杆菌O157的O抗原rfbE基因、志贺肠杆菌ipaH基因、单增李斯特杆菌的毒力标志基因hlyA基因，利用生物学软件Clustal X比对后在高度保守区域用Primer Express 2.0设计一套荧光PCR引物、探针，由上海辉睿生物科技有限公司合成。2.2 模板DNA的制备 采用水煮裂解法:3种菌种在营养琼脂纯化分离后，挑取单个菌落接种于营养肉汤，37 ℃振荡过夜培养，参照国标法 (GB/T4789. 2-2003) 对菌株进行平板计数，均配制成107CFU/ mL浓度的菌液。取1 mL于1.5 mL EP 管中，12 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀用灭菌ddH2O洗涤2次，12 000 r / min 离心5 min，弃上清后加入100 μL灭菌ddH2O，漩涡混匀，封口膜封口，水浴煮沸10 min，置-20 ℃ 10 min，取出溶解，漩涡混合器震荡破碎细菌释放核酸，12 000 r / min 离心 5 min，取上清作为检测模板，-20 ℃保存备用。

2.3 反应体系和反应程序的优化 将各致病菌增菌培养后，分别提取DNA为模板，进行荧光PCR扩增。反应体系为25 μL： 2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL， DNA模板5 μL，以上下游引物各0.4、0.5、0.6 μL(10 μmol/L)，探针各0.4、0.5、0.6 μL(10 μmol/L)进行组合优选，反应程序： 94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，50-58 ℃ 40 s(收集荧光信号)，25、30、35、40、45、50个循环进行优化。根据试验结果确定最佳反应条件和反应参数。

2.4 特异性试验 将大肠杆菌O157、志贺肠杆菌、李斯特杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、致病性链球菌、空肠弯曲菌、副溶血性弧菌、普通变形杆菌、铜绿假单胞杆菌等10种菌株增菌培养后的菌液为模板，使用2.3建立中的反应体系和条件进行荧光PCR扩增，验证所建立的荧光PCR方法的特异性。

2.5 敏感性试验 取已配制成5×107CFU/mL 浓度的大肠杆菌O157、志贺肠杆菌、李斯特杆菌菌液 1 mL，用水煮裂解法提取 DNA 作为模板，进行10倍比梯度稀释。同样使用2.3中建立的反应体系和条件进行单一、三联组合的检测扩增，验证所建立的荧光PCR方法的敏感性。

2.6 应用于临床样品检测 从东莞市某农批市场采集26份冻肉样品，其中猪肉8份、羊肉3份、牛肉4份、鸡肉6份、鸭肉5份，用建立的三重荧光PCR方法进行检测。同时用相应国标法(GB/T 4789.36-2008食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌0157:H7/NM 检验、GB 4789.5-2012食品微生物学检验志贺氏菌检验、GB 4789.30-2010食品微生物学检验单核细胞增生李斯特菌检验)进行验证。

3 结果与分析

3.1 三重荧光PCR方法的建立 最终建立的反应体系为：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，探针各0.5 μL(10 μmol/L)，DNA模板为5 μL，补水至25 μL。反应程序： 94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 40 s(收集荧光信号)，40个循环。3.2 特异性结果 对抽提的10种细菌的基因组DNA，利用建立的荧光定量PCR体系进行检测，结果见图1。由图1可知，建立的检测方法对大肠杆菌O157、志贺肠杆菌、单增李斯特杆菌检测为阳性，其他7株菌株均为阴性，说明该方法具有较好的检测特异性。

图1 三重荧光PCR特异性扩增结果

1：大肠杆菌O157扩增曲线； 2：志贺肠杆菌扩增曲线； 3：单增李斯特杆菌扩增曲线

3.3 敏感性结果 所建立的三重荧光 PCR方法对大肠杆菌O157、志贺肠杆菌、单增李斯特杆菌进行单一扩增的相对灵敏度检测限分别为5×101、5×101和5×103CFU/ mL，进行三联扩增的相对灵敏度检测限分别为5×102、5×102和5×103CFU/mL。具体结果见图2。

图2 大肠杆菌O157灵敏度扩增曲线

图3 志贺肠杆菌灵敏度扩增曲线

图4 单增李斯特菌灵敏度扩增曲线

图5 3种菌浓度均为5×103CFU/mL时的扩增结果

图6 3种菌浓度均为5×102 CFU/mL时的扩增结果

3.4 临床样品检测 建立的荧光PCR方法对26份冻肉样品进行大肠杆菌O157、志贺肠杆菌、单增李斯特杆菌检测，结果1份鸡肉样品与1份猪肉样品检测为大肠杆菌O157阳性，阳性率11.53%；1份牛肉样品中检测出志贺肠杆菌，1份猪肉样品中检测出单增李斯特杆菌。未发现混合感染。国标法结果与荧光PCR方法一致，符合率100%。说明该方法准确可靠，可以广泛应用于临床样品检测。

4 讨论

4.1 与相应国标检测方法比较，建立的三重荧光PCR方法可以特异地检测食源性致病菌：大肠杆菌O157、志贺肠杆菌与单增李斯特杆菌。不但检测所需时间短，减少了工作量，检测成本低，一份样品检测其中一种细菌的费用比之前少了50元左右，更经济，更省力。因此，具有广泛的应用前景。

4.2 建立的方法是针对大肠杆菌O157、志贺肠杆菌、李斯特杆菌等威胁仔猪健康的、引起症状相似的重要细菌，常以混合感染的形式出现，诊断困难。三重荧光PCR检测方法可为政府和养殖户快速、及时的合理处理动物疫病提供技术保障。

4.3 大肠杆菌 O157、志贺肠杆菌、单增李斯特杆菌等被公认是主要的食源性人兽共患致病菌。我国已先后在江苏、山东、河南、安徽、北京等10几个省市发现大肠杆菌O157∶H7 感染的散发病例。1999-2000年，苏、皖、豫地区大规模流行大肠杆菌O157∶H7，造成急性肾功能衰竭患者195 人，死亡177人，病死率达90.8%[9]。食品污染志贺肠杆菌的情况也不容乐观。2003-2004年广西6类食品中志贺肠杆菌检出率为1.45%[10]。单核细胞李斯特菌则可引起以脑膜炎、脑炎、败血症等，死亡率高达30%～70%。目前该菌在美国已成为由食物污染引起死亡的四大病原菌之一。近年来我国也有关于此菌对食品污染的[11]。食品安全极为重要，我国暴发的食源性疾病严重危害着消费者的身体健康,并影响消费者对食品安全的信心。本方法的建立对保证食品安全，具有重要的公共安全意义 。

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2016-07-07

广东省科技计划项目(2013B020410006)

谢海燕(1976-)，女，高级兽医师，硕士，主要从事动物疫病防控分析、技术推广及管理，E-mail：xhy402@hotmail.com

S855.9+9

B

0529-6005(2017)03-0086-03