含有芳杂环片段的喹诺酮类化合物的设计、合成与体外抗病毒活性

李宵宁，殷金秋，柴芸，李玉环，高荣梅，刘明亮

含有芳杂环片段的喹诺酮类化合物的设计、合成与体外抗病毒活性

李宵宁*，殷金秋*，柴芸，李玉环，高荣梅，刘明亮

目的设计合成一系列含有芳杂环片段的喹诺酮类化合物，并评价其体外抗人类巨细胞病毒（HCMV）和抗单纯疱疹病毒 1 型（HSV-1）活性。

喹诺酮类； 化学技术，合成； 抗病毒药；疱疹病毒 1 型，人； 巨细胞病毒

人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是疱疹病毒家族中的重要成员，可引起人类巨细胞病毒感染[1]。单纯疱疹病毒 1 型（herpes simplex virus 1，HSV-1）则是引起口腔和面部损伤的主要病原体，也是疱疹性脑炎的最常见病因[2]。目前常用的抗 HCMV/HSV-1 药物均为病毒 DNA聚合酶抑制剂，因安全性问题和口服生物利用度低等使其临床应用受到很大限制[3]，而近年不断出现的交叉耐药毒株则使其治疗方案复杂化[4]，故寻找和研发新型抗病毒药物势在必行[5]。

喹诺酮是目前临床广泛使用的一类广谱、高效、低毒的一线抗感染化疗药物，主要用于治疗由细菌感染引起的系统性疾病[6]。近 10 余年来，科学家对喹诺酮进行了卓有成效的结构改造，发现这类化合物除抗菌之外还具有多种“非经典”生物活性，并筛选得到若干有苗头的候选物[7]。其中，第 1 个喹诺酮抗肿瘤药物沃萨罗辛（voreloxin，拓扑异构酶 II 抑制剂）[8]和第 1 个喹诺酮抗AIDS 药物埃替格韦（elvitegravir，HIV-1 整合酶抑制剂）[9]已分别于 2009 年和 2012 年被美国FDA 批准上市。

多名学者对 6-氨基喹诺酮的抗病毒构效关系（SAR）进行了系统研究[10-12]。其中，代表物WC5[13-14]（14c）对人类疱疹病毒家族中的 HCMV具有高度的选择性[15]，且与更昔洛韦（GCV）表现出协同作用[16]。本文以 WC5 为先导物，在对其 C7位改造的基础上，对母核的 N1、C6 和 C8 位分别修饰，设计合成一系列含有芳杂环片段的喹诺酮类化合物，并初步评价其抗病毒活性，以期获得对HCMV 和（或）HSV-1 具有抑制活性的化合物，为下一步设计合成活性喹诺酮类化合物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器 梅特勒 MP-70 熔点仪为瑞士梅特勒-托利多公司产品；Mass Express 2.1.243 和Micromass Autospec Ultima-TOF 型质谱仪分别为美国 Advion 公司和 Waters 公司产品；Mercury-400 MHz 和 Inova-500 MHz 型核磁共振仪为美国 Varian 公司产品。

1.1.2 主要试剂 阳性对照药 GCV 和阿昔洛韦（ACV）分别购于美国 Sigma-Aldrich 公司和湖北科益制药厂；色谱用薄层层析硅胶 H 为青岛海洋化工厂产品；其他试剂和溶剂均为市售化学纯或分析纯，根据需要经无水干燥处理后使用。

1.2 方法

1.2.1 化学合成 以 2-氯苯并噁唑（1a）和 2-溴苯并噻唑（1b）为原料，依次经与 N-Boc-哌嗪亲核取代和脱保护基可分别制得侧链化合物 2-哌嗪基苯并噁唑（2a）和 2-哌嗪基苯并噻唑（2b）[17]（图 1）。

按照合成喹诺酮的常规操作[18-19]，6 个母核羧酸酯（8～13）很容易由相应的羧酸（3～7）依次经酰氯化、与丙二酸二乙酯缩合、部分水解并脱羧、与原甲酸三乙酯缩合、亲核取代及环合分别制得（图 2）。

基于我们合成喹诺酮类化合物的成功经验[20-22]，羧酸酯 8 与上述合成的侧链化合物 2a、2b 以及国内有商品供应的 1-(2-吡啶基)哌嗪（2c）、1-(3-吡啶基)哌嗪（2d）和 1-(4-吡啶基)哌嗪（2e）直接缩合，接着依次经酯水解和硝基还原得目标物 14；喹诺酮母核 9～11 则需先经螯合活化，然后与侧链化合物缩合，最后水解即得 15～17；萘啶酮母核 12 和 13 可直接与侧链化合物缩合后水解即得 18 和 19（图 3）。

1.2.2 CPE 法测定体外抗病毒活性 HCMV 和HSV-1 病毒株分别为 HCMV AD-169 株（ATCC VR538）和 HSV-1 F 株（ATCC VR733），病毒宿主分别为人胚胎成纤维细胞（MRC-5）和非洲绿猴肾（Vero）细胞，阳性对照药分别为 GCV 和 ACV。目标化合物用 DMSO 配成浓度为 20 mg/ml 的母液，检测时用培养液稀释浓度为 200 μg/ml，然后进行 3 倍稀释，共 8 个稀释度。试验时，MRC-5细胞和 Vero 细胞分别种 96 孔培养板，24 h 后分别感染 AD-169（100 TCID50）和 HSV-1（100 TCID50），吸附 2 h，弃病毒液，加入含有不同稀释度样品及阳性对照药的维持液，同时设细胞对照孔和病毒对照孔，待病毒对照组病变程度（CPE）达 4+时观察各组 CPE，用 Reed-Muench[23]法分别计算目标化合物对 HCMV 和 HSV-1 的药物半数有毒浓度（TC50）和药物对病毒半数抑制浓度（IC50）。

图1 侧链化合物 2a、2b 的合成Figure 1 Synthesis of compounds 2a and 2b

图2 喹诺酮母核羧酸酯 8～13 的合成Figure 2 Synthesis of compounds 8-13

图3 目标化合物 14～19 的合成Figure 3 Synthesis of target compounds 14-19

2 结果

2.1 目标化合物的合成

共合成目标化合物 22 个（包括 WC5），其结构（图 4）均经1H-NMR、13C-NMR 和 MS 确证，部分化合物还经 HRMS 进一步确证。

2.2 抗病毒活性

2.2.1 抗 HCMV 活性 由表 1 可见，目标物 17和 18b 对 HCMV 有抑制作用[IC50分别为（17.26 ± 1.85）μg/ml 和（11.14 ± 1.69）μg/ml]，但明显弱于先导物 WC5（14c）[IC50：（1.27 ± 0.44）μg/ml]和对照药 GCV[IC50：（0.025 ± 0.005）μg/ml]，其余目标物在无毒浓度下均未测出 IC50。

2.2.2 抗 HSV-1 活性 由表 1 可见，9 个目标物（14d、15d、16c、16d、17、18b、18d、18e、19）在无毒浓度下对 HSV-1 显示抑制作用，其中目标物 19 的活性[IC50：（2.18 ± 0.30）μg/ml]仅略弱于先导物 WC5[IC50：（1.68 ± 0.25）μg/ml]，两者均弱于对照药 ACV[IC50：（0.63 ± 0.09）μg/ml]。

3 讨论

作为抗 HCMV 候选物，6-氨基喹诺酮 WC5具有全新作用机制（直接阻滞病毒 IE2 蛋白转录活性[15]），被认为在对付耐药病毒感染方面可能具有重要意义[14]。作者借鉴喹诺酮的抗菌 SAR，以WC5 为先导物，对其母核的四个位置（N1、C6、C7、C8）进行结构改造，设计合成了一系列含有芳杂环片段的喹诺酮类化合物。由体外活性数据可见：①活性结果大多不如预期，仅部分化合物表现出体外抗病毒活性，故其 SAR 难以总结；②所有对 HCMV 有抑制作用的化合物（17、18b）也同样显示出抗 HSV-1 活性，但两者之间并无直接相关性；③WC5 不仅对 HCMV 具有抑制作用，而且对 HSV-1 显示相似的活性，但对 Vero 细胞毒性大（TC50：22.22 μg/ml）及选择性差（SI：13.23）。

值得注意的是，N1 位为 (1S,2R)-2-氟环丙基（第四代喹诺酮西他沙星的 N1 位取代基）的喹诺酮 17 对 HCMV 和 HSV-1 均有抑制作用，且对两种细胞的毒性均小于 WC5，而 N1 位为(1S,2R)-2-氟环丙基的萘啶酮 19 对 HSV-1 显示良好活性（尽管其细胞毒性较大）。据此，我们认为，很有必要对 1-[(1S,2R)-2-氟环丙基]喹诺酮/萘啶酮的 C6、C7 和 C8 位进行结构修饰，以期筛选出活性更强和毒性更小的化合物。事实上，本课题组已经开始相关的化学合成工作，结果值得期待。

图4 目标化合物 14～19 的结构Figure 4 Structures of target compounds 14-19

表1 目标化合物 14～19 的抗病毒活性Table 1 Antiviral activity of target compounds 14-19

参考文献

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Design,synthesis and in vitro antiviral activity of quinolones containing a heteroaromatic moiety

LI Xiao-ning,YIN Jin-qiu,CHAI Yun,LI Yu-huan,GAO Rong-mei,LIU Ming-liang

ObjectiveTo design and synthesize a series of novel quinolones containing a heteroaromatic moiety,and evaluate their in vitroantiviral (HCMV and HSV-1) activity.MethodsTarget compounds were synthesized through nucleophilic substitution of N-heteroaromaticpiperazines with different quinolone cores.Their structures were characterized by1H-NMR,13C-NMR,MS and HRMS.In vitro antiviral (HCMV and HSV-1) activity of the compounds was evaluated by CPE assay.ResultsTwenty-two compounds including WC5 were synthesized in this study.Some compounds were found to have inhibition against HCMV and/or HSV-1.Compound 19 [IC50:(2.18 ± 0.30) μg/ml]is slightly less active than WC5 [IC50:(1.68 ± 0.25) μg/ml]against HSV-1.ConclusionThe study enriches the structure activity relationship of quinolone against HCMV/HSV-1,which lays the foundation for the future design of novel quinolones with potent activity.

Quinolones; Chemistry techniques,synthetic; Antiviral agents; Herpesvirus 1,human; Cytomegalovirus

LIU Ming-liang,Email:lmllyx@126.com

国家自然科学基金青年科学基金（81502923）

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所有机化学室

刘明亮，Email：lmllyx@126.com

2017-01-16

*同为第一作者

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.003

方法N-芳杂环基哌嗪与喹诺酮母核化合物通过亲核取代反应制备目标物，其结构经1H-NMR、13C-NMR、MS 和HRMS 确证。CPE 法测定所有目标物对细胞的 TC50及对HCMV 和 HSV-1 的 IC50值。

结果合成了 22 个喹诺酮类化合物（包括先导物 WC5）。部分目标物对 HCMV 和（或）HSV-1 有抑制作用，其中化合物 19 对 HSV-1 的 IC50为（2.18 ± 0.30）μg/ml，略弱于 WC5 的（1.68 ± 0.25）μg/ml。

结论丰富了喹诺酮类化合物抗病毒构效关系，并为下一步设计合成活性喹诺酮类化合物奠定基础。

Author Affiliation:Department of Medicinal Chemistry,Institute of Medicinal Biotechnology,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Beijing 100050,China