调控基因对万古霉素生物合成的影响

韩婷，魏维，戈梅，钱秀萍

调控基因对万古霉素生物合成的影响

韩婷，魏维，戈梅，钱秀萍

目的通过对东方拟无枝酸菌的调控基因进行研究及改造以获得高产万古霉素的突变株。

万古霉素； 调节元件，转录； 东方拟无枝酸菌

20 世纪 80 年代，由于 β-内酰胺类抗生素的大量使用，耐甲氧西林金葡菌（MRSA）逐渐流行，目前，万古霉素是临床上用于由 MRSA 引起的严重感染性疾病的一线药物，受到人们的重视[1]。东方拟无枝酸菌（Amycolatopsisorientalis）是万古霉素的产生菌，属革兰阳性放线菌，假诺卡菌亚目，假诺卡菌科，拟无枝菌酸菌属[2]，历史上曾将其归为链霉菌属，诺卡菌属。近年来国内许多学者通过对万古霉素产生菌的反复自然分离、物理化学方法诱变和发酵条件优化等途径提高其产量[3-5]。

随着生物化学、分子生物学等的发展，万古霉素产生菌的分子信息越来越清晰，2014年，Xu等[6]对一株万古霉素高产菌东方拟无枝酸菌HCCB10007 进行了全基因组测序，就其基因序列与已报道的基因序列比对与分析，推测到有 10%的基因编码调控蛋白，本研究从中选取了AORI_1475、AORI_1832、AORI_2956、AORI_3531、AORI_3398、AORI_7412 六个基因进行过表达实验，考察这六个调控基因对万古霉素合成的作用。AORI_1475 推测为 strR 型转录调控基因，可能与Amycolatopsisbalhimycina 中的 bbr（strR 型转录调控基因）一样起正调控作用[7]。AORI_1832、AORI_2956 和 AORI_3531 推测为 araC 型转录调控基因，可能也具有正调控作用，因为有文献报道 araC 型的 rapG 正调控雷帕霉素（产生菌为链霉菌属）的合成[8]。AORI_3398、AORI_7412 推测为 lysR 型调控基因，lysR 被认为是全局转录调控基因，一般作为激活子或阻遏子起作用。微生物的次级代谢途径受许多调控基因影响，通过对HCCB10007 中数个调控基因的研究，确定其对万古霉素合成的影响，为提高万古霉素产量，减少副产物的发酵工艺完善提供重要的线索。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株和质 粒 东方拟无枝酸菌HCCB10007、E.coli JM110 由上海来益生物药物研发中心保藏，E.coli DH5α 购自天根生化科技（北京）有限公司；质粒 pLYW2（pSET152含有 ermEp*启动子）由上海来益生物药物研发中心提供，pMD19-Tsimple vector 购自日本 Takara 公司。

1.1.2 培养基 LB 培养基、TSB 培养基、高氏1 号培养基、本氏培养基、种子培养基及发酵培养基配方参见文献[9]。

1.2 实验方法

1.2.1 六个调控基因的调取及验证 参考文献[10]提取 HCCB10007 基因组，采用 PCR 方法调取六个调控基因，所用引物见表 1，亚克隆后测序验证。

1.2.2 调控基因过表达质粒的构建 利用Nde I/Xba I 酶切调取到的调控基因和质粒pLYW2，并用 T4 连接酶连接起来，构建过表达质粒 pLYW2-1475、pLYW2-1832、pLYW2-2956、pLYW2-3531、pLYW2-3398、pLYW2-7412，构建流程如图 1 所示。

1.2.3 过表达菌株的构建与验证 文献报道东方拟无枝酸菌存在限制-修饰（R-M）系统[11]，因此先将构建好的过表达质粒电转进 E.coli JM110，再将JM110 转化子中的过表达质粒电转入东方拟无枝酸菌 HCCB10007。

1.2.4 过表达菌株的发酵及发酵产物的验证 发酵培养条件参考文献[12]。发酵液用 4 mol/L 的HCl 调 pH 至 4～4.5，4 ℃ 高速离心，取上清液于 HPLC 检测。

表1 本实验所用 PCR 扩增引物Table 1 PCR primers used in this study

2 结果

2.1 六个调控基因的调取及验证

PCR 方法成功提取到 HCCB10007 基因组，调取到的调控基因经测序验证正确。

2.2 调控基因过表达质粒的构建与验证

抽提 JM110 转化子的过表达质粒，Pst I 酶切验证，经计算，pLYW2-1475、pLYW2-2956、pLYW2-3398、pLYW2-7412 应切出约 0.8、2.6、3.5 kb 三条带；LYW2-1832 应切出约 0.8 和 2.6 kb两条带；pLYW2-3531 应切出约 0.8、0.9、2.6 kb 三条带。实际酶切结果如图 2 所示，与理论值相符。

2.3 过表达菌株的构建与验证

挑取东方拟无枝酸菌转化子于 TSB 液体培养3 d，菌液 PCR 验证，由于调控基因本就来自HCCB10007，所以 PCR 验证时，设计引物将质粒上红霉素启动子基因 ermP 与调控基因一起PCR，得到的条带应约为 1.2 kb。实际 PCR 结果如图 3 所示，由此可证实已获得调控基因过表达菌株 HHT1475、HHT1832、HHT2956、HHT3531、HHT3398 和 HHT7412。

2.4 过表达菌株的发酵及发酵产物的验证

过表达菌株发酵 5 d，发酵液预处理后经HPLC 分析。分析检测结果如图 4 所示，过表达菌株 HHT1475、HHT1832、HHT2956、HHT3531 的万古霉素峰面积均高于 HCCB10007，特别是HHT1475 和 HHT1832 分别提高了 55% 和51%，HHT2956 和 HHT3531 分别提高了 18% 和29%，而 HHT3398 和 HHT7412 却下调了万古霉素的量，都降低了 12% 左右。可以初步判断，AORI_1475、AORI_1832、AORI_2956、AORI_3531在万古霉素合成中起正调控作用，而 AORI_3398、AORI_7412 起负调控作用，而且 AORI_2956、AORI_3531、AORI_3398、AORI_7412 的调控作用不明显。

图1 过表达质粒构建流程Figure 1 Construction of overexpression plasmids

图2 过表达质粒 Pst I 酶切验证Figure 2 Overexpression plasmids digestion by Pst I

图3 过表达菌株 PCR 验证Figure 3 Mutants verification by PCR

图4 HCCB10007 和过表达菌株的万古霉素和无糖万古霉素的产量Figure 4 Product of HCCB10007 and other overexpression strains

对其他发酵产物分析发现，过表达菌株HHT1475 的无糖万古霉素的产量约为 HCCB10007的 5 倍，HHT1832 约为 HCCB10007 的 7 倍，其他菌株与原始菌株 HCCB10007 相差不大。

3 讨论

根据生物信息分析，万古霉素基因簇位于基因组的核心区，共编码 35 种酶（AORI_1471 到AORI_1505）。AORI_1475 推测为 strR 型调控基因，存在于万古霉素合成基因簇内[6]，为万古霉素合成途径特异性调控基因，这可能是 AORI_1475明显提高万古霉素产量的原因之一。作为可能的全局性调控基因，AORI_1832 位于万古霉素合成基因簇外，但非常靠近合成簇，所以其也明显上调了万古霉素的产量。根据其他发酵产物量的变化，推测这两个基因是通过调控万古霉素的前体——无糖万古霉素的合成来调控万古霉素的产量，但具体怎样调控还需进一步研究。AORI_2956、AORI_3531、AORI_3398、AORI_7412 的调控作用都比较弱，可能有两个原因：①这四个基因距离万古霉素基因簇比较远，可能是间接调节基因簇中的某个基因或者调节其他次级代谢途径。②可能存在反馈调节。万古霉素生物合成是由一个复杂的代谢网络调控而成的，怎样从调控基因入手，提高万古霉素的生物合成，还需更详细的研究。

[1]Foldes M,Munro R,Sorrell TC,et al.In-vitro effects of vancomycin,rifampicin,and fusidic acid,alone and in combination,against methicillin-resistant Staphylococcus aureus.J Antimicrob Chemother,1983,11(1):21-26.

[2]Xu LH,Li WJ,Liu ZH,et al.Systematics of actinomyces-principle,method and practice.Beijing:Science Publishing,2007.(in Chinese)徐丽华,李文均,刘志恒,等.放线菌系统学——原理、方法及实践.北京:科学出版社,2007.

[3]Jiang L,Wu JG,Chen WW,et al.Streptomycin-resistant screening of high yield vancomycin producing strain.Chin J Antibiot,2005,30(2):70-72.(in Chinese)江凌,邬建国,陈伟伟,等.链霉素抗性突变——万古霉素高产菌株的选育研究.中国抗生素杂志,2005,30(2):70-72.

[4]Ruan LJ,Zhao CJ,Jin ZH,et al.Improvement of vancomycin producing strain and optimization of the fermentation medium.Chin J Antibiot,2003,28(3):134-136,143.(in Chinese)阮丽军,赵成建,金志华,等.万古霉素产生菌的选育与发酵培养基优化.中国抗生素杂志,2003,28(3):134-136,143.

[5]Chen DJ,Li JA,Zou YH,et al.Process develoment of vancomycin.Chin J Antibiot,2004,29(1):8-10,56.(in Chinese)陈代杰,李继安,邹韵华,等.万古霉素的研究开发.中国抗生素杂志,2004,29(1):8-10,56.

[6]Xu L,Huang H,Wei W,et al.Complete genome sequence and comparative genomic analyses of the vancomycin-producing Amycolatopsis orientalis.BMC Genomics,2014,15:363.

[7]Shawky RM,Puk O,Wietzorrek A,et al.The border sequence of the balhimycin biosynthesis gene cluster from Amycolatopsis balhimycina contains bbr,encoding a StrR-like pathway-specific regulator.J Mol Microbiol Biotechnol,2007,13(1-3):76-88.

[8]Kuscer E,Coates N,Challis I,et al.Roles of rapH and rapG in positive regulation of rapamycin biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus.J Bacteriol,2007,189(13):4756-4763.

[9]Zhou YM,Hong WR,Ruan LG,et al.The effect of chlorine on the fermentation products of Amycolatopsis orientalis.Chin J Antibiot,2008,33(5):273-275,292.(in Chinese)周雨朦,洪文荣,阮林高,等.氯离子对东方拟无枝酸菌发酵产物的影响.中国抗生素杂志,2008,33(5):273-275,292.

[10]Kieser T,Bibb MJ,Buttner MJ,et al.Practical streptomyces genetics.Norwich,England:The John Innes Foundation,2000.

[11]Li YM,Xu JY,Xu L,et al.Heterologous expression of bgtfA in amycolatopsis orientalis and identificationof the catalysate.Pharma Biotechnol,2013,20(3):207-209.(in Chinese)李彦美,许激扬,徐莉,等.bgtfA在东方拟无枝酸菌中异源表达及其产物鉴定.药物生物技术,2013,20(3):207-209.

[12]Wei W,Huang H,Ruan LG,et al.Optimization of fermentation conditions for the production of a novel glycopeptide compound by genetic engineered Amycolatopsis orientalis.Chin J Antibiot,2010,35(10):755-759.(in Chinese)魏维,黄鹤,阮林高,等.东方拟无枝酸菌基因工程菌产新糖肽类化合物的发酵条件优化.中国抗生素杂志,2010,35(10):755-759.

Effect of several regulatory genes on the biosynthesis of vancomycin

HAN Ting,WEI Wei,GE Mei,QIAN Xiu-ping

ObjectiveThe objective of this study was to obtain the mutant strains with high productivity of vancomycin through studying and transformation of regulatory genes in Amycolatopsisorientalis.MethodsSix putative regulatory genes AORI_1475,AORI_1832,AORI_2956,AORI_3531,AORI_3398 and AORI_7412 were selected based on DNA sequence analysis of HCCB10007 genome,and overexpressed in this study,respectively.ResultsThe yields of vancomycin of the first four overexpressed strains were increased by 55%,51%,18%,29% while the last two were reduced by about 12%.ConclusionAORI_1475,AORI_1832,AORI_2956 or AORI_3531 plays positively regulatory roles in vancomycin synthesis while AORI_3398 and AORI_7412 negatively regulate the synthesis.Furthermore,the regulatory role of AORI_2956,AORI_3531,AORI_3398 or AORI_7412 is weak.

Vancomycin; Regulatory elements,transcriptional; Amycolatopsisorientalis

QIAN Xiu-ping,Email:qianxp@sjtu.edu.cn

国家高技术研究发展计划（863 计划）（2012AA02A706）

200240 上海交通大学药学院（韩婷、魏维、钱秀萍）；201203上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司（魏维、戈梅）

钱秀萍，Email：qianxp@sjtu.edu.cn

2016-11-28

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.005

方法选取经基因组测序分析获得的 6 个推测具有调控作用的基因：strR 型的 AORI_1475、araC 型的AORI_1832、AORI_2956、AORI_3531 和 lysR 型的 AORI_3398、AORI_7412 进行过表达实验。

结果发现 AORI_1475、AORI_1832、AORI_2956、AORI_3531 的过表达分别将万古霉素产量上调了 55%、51%、18%、29%，而 AORI_3398、AORI_7412 却使万古霉素产量下降了 12% 左右。

结论初步判断 AORI_1475、AORI_1832、AORI_2956、AORI_3531 对万古霉素合成有正调控作用，而 AORI_3398、AORI_7412 对万古霉素合成起负调控作用。

Author Affiliations:School of Pharmacy,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240,China (HAN Ting,WEI Wei,QIAN Xiu-ping); Shanghai Laiyi Center for Biopharmaceutical R&D,Shanghai 201203,China (WEI Wei,GE Mei)