白藜芦醇对甲基乙二醛损伤BRL-3A细胞的抑制作用

武召珍，代少华，冯翠霞，李 超，2，董 强*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.错那县觉拉乡人民政府，西藏错那 856700)



白藜芦醇对甲基乙二醛损伤BRL-3A细胞的抑制作用

武召珍1，代少华1，冯翠霞1，李 超1，2，董 强1*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.错那县觉拉乡人民政府，西藏错那 856700)

为研究甲基乙二醛(MGO)对大鼠肝细胞BRL-3A细胞的损伤机制，在MGO存在的情况下，以50 μmol/L白藜芦醇处理BRL-3A，分别用MTT法检测细胞活力；DNPH法检测细胞内Schiff base浓度；DCFH-DA荧光探针法检测ROS水平；以及脂质过氧化产物MDA含量的检测。结果表明，MGO导致细胞内Schiff base、ROS和MDA显著增加，诱导细胞发生氧化应激，白藜芦醇处理可有效改善MGO对细胞的损伤作用。

甲基乙二醛；白藜芦醇；BRL-3A；氧化应激

在临床肝病学的发展中，非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)受到越来越多的关注。调查发现，NAFLD具有相当高的发病率。美国成年人的发病率可达到25%左右，日本人和意大利人也有相似的发病率[1]。NAFLD的主要特征是肝脏脂质尤其是甘油三酯的积累，而脂质积累与脂质过氧化和氧化应激密切相关[2]。文献报道，氧化应激是NAFLD发生的一个关键因素[3]。另外，NAFLD病人还表现为体内炎症因子分泌增加和血糖升高等[2]。甲基乙二醛(methylglyoxal,MGO)作为一种常见的活性羰基化合物，普遍存在于机体的组织和细胞中。内源性的MGO可通过机体内碳水化合物的氧化、细胞膜脂质过氧化和氨基酸的氧化等多种途径生成[4-6]。细胞内大多数的MGO主要来源于葡萄糖代谢和果糖代谢反应[7-8]，脂质代谢来源的MGO是由甘油、乙酸乙酯和丙酮经酶或非酶反应转化而来[5]。外源性的MGO主要来自咖啡、烘焙以及油炸食物等，它们很容易从外环境中穿过细胞膜而存在于细胞质内[9-10]。MGO因具有高活性羰基而易对蛋白质的氨基酸残基进行修饰，形成晚期糖基化终末产物(advanced glyxation end products,AGEs)。随着机体内AGEs的积累，氧化应激的标志物晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)表达升高，导致氧化应激[11-12]。此外，MGO可直接增加大鼠主动脉中超氧阴离子等活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生，引起氧化应激[13]。白藜芦醇是一种天然多酚类化合物，具有很强的抗氧化功能，可作为一种细胞的抗氧化保护剂[14]。因此，本研究以大鼠肝细胞BRL-3A为研究对象，初步探究MGO对BRL-3A的损伤以及白藜芦醇对BRL-3A的保护机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 白藜芦醇、MGO、氨基胍(aminoguanidine, AG)、DCFH-DA探针、四甲基偶氮唑盐(MTT)、2,4-二硝基苯肼(DNPH)，Sigma公司产品；DMEM培养基，Gibco公司产品；胎牛血清，Hyclon公司产品；硫代巴比妥酸(TBA)等其他试剂，均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器 930A荧光光度计，雷磁PHS-3E型pH计，GNP-9080型隔水式恒温培养箱，倒置相差显微镜，全波长酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 大鼠肝细胞系BRL-3A，购自中科院上海细胞库。BRL-3A细胞用含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM培养基培养于体积分数为5%的CO2的37℃恒温培养箱中。

1.2.2 细胞活力检测 细胞活力用MTT法检测。96孔板以每孔相同数量的细胞做不同处理，24 h之后加入MTT溶液(20 μL，5 mg/mL)继续培养4 h。弃去培养基并加入150 μL二甲基亚砜溶解细胞内的蓝紫色结晶甲瓒，490 nm处测定光吸收值[15]。细胞活力=(处理组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.3 非酶糖基化产物Schiff base的检测 BRL-3A经不同试验组处理24 h后，预冷的PBS清洗细胞2次。细胞经裂解15 min后，14 000 r/min离心10 min，收集上清。0.5 mL上清液与等量的DNPH(1 mg/mL)室温暗环境中孵育1 h，加入1 mL TCA(200 mg/mL)终止反应，静置10 min。10 000 r/min离心10 min，弃上清，以乙酸乙酯和乙醇混合液(1∶1)洗涤3次～4次，自然晾干，1 mL 6 mol/L的盐酸胍(pH2.3)超声溶解之后，374 nm测吸光度值，以22000 (mol/L)-1cm-1消光系数(ε)计算出Schiff base生成量。C(nmol/mL)=OD 370 nm (实验组-对照组)×106/ε[16]。

1.2.4 细胞内ROS的检测 处理BRL-3A细胞24 h后，用预冷的PBS清洗2次并收集。细胞与DCFH-DA工作液(2 μmol/L)在37℃暗环境下孵育20 min。用荧光分光光度计检测荧光值，激发光为485 nm，发射光为535 nm。

1.2.5 细胞脂质过氧化产物丙二醛的检测 处理BRL-3A 24 h后，用预冷的PBS清洗细胞。10 mL/L Trition X-100裂解细胞20 min，分别取200 μL细胞匀浆、50 μL 700 g/L三氯乙酸(TCA)加入玻璃管中并振荡，另加入150 μL超纯水和200 μL TBA，振荡。沸水中煮沸20 min后冰上冷却5 min，4 000 r/min离心5 min，取200 μL于酶标板中532 nm处测吸光度。

1.2.6 数据统计与分析 数据采用Graphpad Prism 5分析软件进行分析，结果用平均值±标准差(n=3)表示，数据差异显著性分析采用t检验。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 白藜芦醇对BRL-3A细胞活力的影响

如图1所示，5 μmol/L～100 μmol/L白藜芦醇可使细胞活力升高。5 μmol/L和10 μmol/L白藜芦醇可显著增加细胞活力，而20、50、100 μmol/L白藜芦醇使细胞活力有轻微升高，但不明显。0.8 mmol/L MGO处理BRL-3A细胞24 h后，能显著减弱细胞活力，50 μmol/L和100 μmol/L白藜芦醇可减弱MGO毒性，并且50 μmol/L白藜芦醇的作用更明显(图2)。

2.2 白藜芦醇对MGO诱导的Schiff base的影响

如图3所示，0.8 mmol/L MGO促进BRL-3A细胞Schiff base的生成，50 μmol/L白藜芦醇可对Schiff base的生成有明显的抑制作用。活性羰基清除剂AG作为阳性对照，对Schiff base的生成同样有明显的抑制作用。

与对照组相比，*P<0.05

与对照组相比，*P<0.05；与MGO组相比，#P<0.05

2.3 白藜芦醇对细胞内ROS水平的影响

如图4所示，MGO明显增加细胞内ROS水平，50 μmol/L白藜芦醇可对MGO的作用有明显的抑制效果，1 mmol/L AG同样可减少细胞内的ROS水平。

2.4 白藜芦醇对细胞脂质过氧化产物丙二醛生成的影响

如图5所示，0.8 mmol/L MGO促进BRL-3A细胞 MDA，50 μmol/L白藜芦醇可对MDA的生成有明显的抑制作用，1 mmol/L AG对MDA的生成也有明显的抑制作用。

与对照组相比，*P<0.05；与MGO组相比，#P<0.05

与对照组相比，*P<0.05；与MGO组相比，#P<0.05

与对照组相比，*P<0.05；与MGO组相比，#P<0.05

3 讨论

MGO对BRL-3A细胞的IC50为1.6 mmol/L(数据未显示)，因此本研究所用的MGO浓度在半数致死浓度以下，为0.8 mmol/L。外环境中的MGO很容易穿过细胞膜而存在于细胞质内[9-10]，进入细胞内的MGO可与蛋白质的氨基酸经过多步反应生成AGEs。首先，MGO与蛋白游离的氨基生成Schiff base，经过Amadori重排之后即形成Amadori产物。其次，这些非酶糖基化的衍生物会再次与游离氨基结合，经过一系列反应形成稳定的化合物，这些化合物即为AGEs。由于MGO属于α醛酮，易与蛋白质氨基酸发生非酶糖基化反应生成Schiff base[17-18]。因此，Schiff base含量常被用来反应蛋白羰基化程度。蛋白发生羰基应激会最终形成稳定的AGEs，AGEs与RAGE结合后可介导一系列的细胞信号通路反应，引起氧化应激和ROS水平增加。此外，MGO可直接导致机体内ROS水平升高[19]。试验表明，MGO可增加大鼠主动脉中超氧阴离子和ONOO-的产生[13]。

白藜芦醇主要从药用植物虎杖中提取而得，具有抗癌、抗炎等作用，当机体产生ROS时，它有较强的抑制作用和自由基的清除作用[20]。在正常的线粒体内，白藜芦醇可通过调节ROS主要来源的复合体Ⅰ和Ⅲ而调节线粒体的呼吸链[21]。另外，它可提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽S-转移酶等的活性。而当金属离子诱导机体氧化应激时，白藜芦醇可凭借其较强的抗氧化能力来保护细胞不受氧化应激的损伤并提高细胞活力[22]。有证据表明，过氧化氢诱导人牙龈成纤维细胞发生氧化应激时，可有效减少ROS产生，保护细胞[22]。本试验所用另外一种抑制剂AG为MGO等活性羰基化合物的捕获剂，早在20世纪就已被报道作为非酶糖基化反应中间产物的捕获剂或清除剂，与二羰基化合物反应生成三嗪类物质[23]。

在本研究中，MGO处理导致BRL-3A细胞内Schiff base浓度、ROS水平和MDA含量升高，表明BRL-3A细胞已被诱导发生了氧化应激。而白藜芦醇可显著降低细胞内Schiff base、ROS以及MDA水平。并且，MGO处理使BRL-3A细胞活力降低，50 μmol/L白藜芦醇可明显提高细胞活力。本研究确定了MGO可导致BRL-3A细胞发生氧化应激，而白藜芦醇可通过降低氧化应激水平起到保护细胞的作用。

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Inhibitory Effect of Resveratrol on Damage of BRL-3A Cells by MGO

WU Zhao-zhen1,DAI Shao-hua1,FENG Cui-xia1,LI Chao1，2,DONG Qiang1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China；2.GovernmentofJuelaCuonaCounty,Cuona,Tibet,856700,China)

To explore the damaged mechanism of methylglyoxal (MGO) on the cell line of BRL-3A,50 μmol/L resveratrol was used to treate BRL-3A cells in the presence of MGO.Cell viability was detected by MTT assay,the concentration of Schiff base was measured by DNPH assay,and the level of ROS was detected using DCFH-DA probe as well as the content of lipid peroxidation product MDA was detected. Results showed that MGO significantly increased levels of Schiff base,ROS and MDA, and induced oxidative stress in BRL-3A cells.However,resveratrol treatment can effectively ameliorate the damage of cells by MGO.

methylglyoxal; resveratrol; BRL-3A; oxidative stress

2016-09-18

武召珍(1989-)，女，河南商丘人，硕士研究生，主要从事动物临床疾病研究。

S852.33;S853.74

A

1007-5038(2017)04-0083-04

*通讯作者