流产衣原体研究进展

张志君，周继章

(中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室， 甘肃兰州 730046)



流产衣原体研究进展

张志君，周继章*

(中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室， 甘肃兰州 730046)

流产衣原体(Chlamydiaabortus)属于衣原体科(Chlamydiaceae)、衣原体属(Chlamydia)，系一类细胞内寄生的革兰阴性原核型微生物。流产衣原体导致羊的流产、死胎，严重威胁养羊业。流产衣原体不仅可以感染羊，还可以感染怀孕妇女。在病原的诊断方面，分子生物学技术因其快速与相对灵敏性的优点得到快速发展，然而细胞分离培养仍然是鉴定流产衣原体的“金标准”。在防治方面，疫苗免疫是预防流产衣原体的理想措施，在我国流产衣原体灭活疫苗已获得国家一类新兽药证书并可以为羊提供有效地免疫保护。疫苗与抗菌药物的合理使用可以为羊群提供很好的保护。

羊；流产衣原体； 诊断；防治

衣原体是一类感染宿主广泛、致病表现复杂的革兰阴性专性细胞内寄生菌，直径0.2 μm～0.5 μm，能够通过0.45 μm的滤器。衣原体是一种重要的人畜共患病原体可以引起广泛的家禽、哺乳动物和人的衣原体病[1]。

衣原体目下设有8个科，其中的衣原体科有9个种，即沙眼衣原体(C.Trachomatis)、 猪衣原体(C.suis)、鼠衣原体(C.muridarum)、肺炎衣原体(C.pueumoniae)、流产衣原体(C.abortus)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)、猫衣原体(C.felis)、豚鼠衣原体(C.caviae)、 反刍动物衣原体(C.pecorum)[2]。2014年又新纳入了2个衣原体种，即感染鸽子和鹦鹉鸟的鸟衣原体(C.avium)和感染鸡和火鸡的家禽衣原体(C.galinacea)[3]。但是有部分学者认为，这2个种有别于其他9个种[4]。

衣原体有DNA和RNA两种遗传物质，具有复杂的双向发展阶段，即代谢不活跃的原生小体(EB)和代谢活跃的网状体(RB)两个阶段。衣原体感染过程发生在EB阶段，EB吸附宿主细胞后，细胞将其摄入形成膜泡。内化的EB有感染性无复制性，而RB有复制性无感染性。在宿主细胞裂解之前EB转变成为RB[5]。在RB阶段，衣原体和宿主细胞之间发生复杂的相互作用，衣原体可以产生一些物质干扰宿主细胞的信号通路,以达到自我生存的目的[6]。

1 流产衣原体感染特征

羊衣原体病(Ovine chlamydisis)是由流产衣原体引起的羊传染病。除了澳大利亚和新西兰外，流产衣原体在全世界流行[7]。流产衣原体主要寄生于羊生殖道黏膜表面的上皮细胞内[8]。不同年龄段的羊都可感染且临床表现不同。新生羔羊主要以关节炎、脑炎症状为主；公羊主要以睾丸炎症状为主；母羊典型的临床症状是妊娠后期流产，绝大多数发病是由于羊在怀孕前就已处于流产衣原体的持续感染状态[9]。羊在怀孕前不会表现流产衣原体的感染症状，有研究指出是由于羊在感染流产衣原体后机体的IFN-γ快速分泌，抑制流产衣原体使其处于一种休眠状态[10]。母羊在流产后会获得免疫保护并且可以进行成功的繁殖，但其仍成为衣原体的携带者，会在以后的发情期将大量的EB排出体外，成为重要的传染源[8]。孕妇与感染的动物直接接触也会造成急性流产[11]。

2 流产衣原体的遗传特性

流产衣原体具有紧凑性基因组，并且衣原体基因簇的大小可以满足衣原体基因复制、转录和翻译所需要的多基因最小串联簇，且基因无冗余性(基因冗余为一条染色体上出现一个基因的很多复份)[12]。衣原体DNA具有很强的重组修复能力，有利于衣原体的生存。在代谢方面，大多数衣原体具有相似的编码基因，编码产物参与衣原体的有氧呼吸[12]。研究衣原体的基因组发现所有的衣原体都有一个发达的、完整的Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system，TTSS)，介导衣原体与宿主细胞发生相互作用[12]。虽然TTSS的结构成分在所有的衣原体中非常保守，但效应分子具有多样化性，且许多效应分子的功能仍有待确定[13]。

3 流产衣原体的诊断

羊衣原体病和布鲁菌病的临床症状十分相似，感染后都有较长的潜伏期。仅依据临床症状和剖检病理变化观察不能确诊，需要借助一定的实验室诊断方法才能确诊[14]。

3.1 衣原体病原学诊断

3.1.1 染色涂片 衣原体具有特殊的染色特性。涂片染色法包括碘染色法、Gimenez染色、荧光抗体染色等。

碘染色法是将衣原体感染的组织、鸡胚卵黄囊膜、细胞培养物进行涂片，酒精灯外焰烘干或自然干燥后。用碘液染色，碘染色液风干后。用光学显微镜观察包涵体。正常情况下，细胞浆中出现3个以上的红褐色或暗褐色的糖原块出现时，确定为衣原体阳性。碘染色法具有简单快速的优点，但是其灵敏度不高，假阳性高[15]。

Gimenez染色是将衣原体感染组织、鸡胚卵黄囊膜、细胞培养物进行涂片，酒精灯外焰烘干或自然干燥后。用甲醛固定3 min，甲醛自然干燥后。用吉姆萨染色液染色30 min，用无菌生理盐水冲洗染色液后自然风干，光学显微镜的油镜观察包涵体[16]。不同阶段的衣原体染色不同，EB在细胞外吉姆萨染色呈紫色，RB较EB体积大二至数倍，染色呈蓝色。吉姆萨染色具有特异性高，结果较可靠的优点。但其灵敏度不及荧光抗体染色。

荧光抗体染色是利用抗体与荧光素结合后，即具有与相应抗原结合的抗体特性，又具有在荧光显微镜下检测的特性，故可以作为一种衣原体特异性检测试剂。流产衣原体检测使用的抗体多为鼠抗流产衣原体LPS单克隆抗体或鼠抗流产衣原体MOMP单克隆抗体[17]，生物素标记的二抗多为羊抗鼠的IgG抗体[18-19]。本技术较其他鉴定细菌的血清学方法有速度快、操作简单、敏感性高等特点，有研究报道同时用碘染色法、姬姆萨染色法，以及荧光抗体染色法对细胞培养物检测沙眼衣原体。结果表明，免疫荧光法的敏感度最高(30.0%,48/160), Giemsa法次之(26.9%,43/160),碘染色法较低(24.4%,39/160)[20]。

3.1.2 电镜观察 电子显微技术可以在检测流产衣原体的同时研究衣原体的细胞结构。继而研究新发现的衣原体结构和功能，为分析结构与功能的关系提供新的视角。Wilkat等应用扫描透射电子显微成像技术、免疫电镜技术、低温扫描电子显微镜技术取代高压冷冻技术来研究流产衣原体[21]。电镜技术的发展为进一步研究流产衣原体提供了技术支持。

3.1.3 病原分离培养 衣原体的分离培养分为鸡胚分离培养法和细胞分离培养法。

1956年，我国学者汤飞凡等用鸡胚卵黄囊接种法，在世界上首次成功分离出沙眼衣原体,此后,各国学者用该方法分离、培养了多种衣原体[22]。目前我国多利用鸡胚接种病料的方法来分离培养衣原体。在鸡胚接种病料培养流产衣原体的基础上，收集鸡胚卵黄囊膜和尿囊液，作为样本。但是鸡胚培养法费时费力，且鸡胚的接种日龄、鸡胚生产季节等缺陷都是本方法的极大局限。

1994年WHO推荐采用细胞培养法来培养衣原体，此方法结果可靠。被认为是评价衣原体的“金标准”。目前衣原体敏感的细胞有Hela细胞、BHK细胞、L929细胞、McCoy[23]等。但是并不是所有的实验室都具有细胞培养的设施和专业知识，并且细胞培养有技术复杂、耗时等缺陷。

3.2 衣原体血清学诊断

3.2.1 补体结合实验 据世界动物卫生组织(OIE)陆生动物疫病诊断手册(2012)，动物衣原体最常用的血清学检测方法是补体结合试验(complement fixation test,CFT)。然而，此技术需要大量的劳动力，灵敏度差，而且容易受到衣原体种之间的交叉反应干扰 。而且此方法不能确定衣原体潜伏期感染[24]。因此，当把没有任何临床症状但处于潜伏期的羊引进农场，饲养到产羔时就会表现明显的临床症状，此时再采取有效的防治措施，经济损失也不可避免[25]。

3.2.2 酶免检测 酶免检测(enzyme-immune assay,EIA)技术是运用抗衣原体LPS的单抗或多抗检测衣原体[26]。Tanaka M等用PCR以及EIA对人的子宫颈拭子和尿液样本进行检测沙眼衣原体，相对敏感性分别为100%和79.3%，可见PCR比EIA敏感性要高，但PCR需要培训专业操作人士。EIA的优点是可应用于大批量临床病料的检测,以及判断实验结果无人为的主观性。

3.2.3 间接血凝试验 Benedict曾用衣原体抗原致敏鞣化的红细胞做间接血凝试验(indirect hemagglutination assay,IHA)，但并没有在其他实验室进行过可靠性和有效性的检验。姜天童等[27]用IHA检测22份人工感染的猪血清和18份高免血清，检测结果100%阳性，血凝效价最高达1∶8 192，比CF和ICF分别敏感8倍～16倍和64倍～128倍。IHA重复性和特异性较好，但判定结果需要肉眼观察，具有一定的主观性。

3.2.4 酶联免疫吸附试验 20世纪80年代，我国农业部将IHA和CFT纳入动物衣原体病检疫规程。然而由于二者方法灵敏性低，特异性低，使其在实际应用中受到一定的限制。因此，我国学者邱昌庆等[28]用建立的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)成功地检测了奶牛的流产衣原体。陈红英等[29]用建立的Dot-ELISA对猪的衣原体进行了成功的检测，试验证明用Dot-ELISA检测猪衣原体比ICF敏感,而且特异性好。但由于这些检测方法成本相对较高，目前还难以大面积在基层推广应用。

3.2.5 免疫胶体金技术 在免疫组织化学方面及免疫分析中，免疫胶体金技术(immune colloidal gold technique)作为一种标记物，可以对细胞或某些标本中的生物大分子进行定位及定性检测。然而抗原和抗体之间的反应是非常复杂的并不是单纯的“钥匙和锁”的关系[30]。将胶体金制备成不同规格、不同标记来检测多种抗原是十分有限的[21]。为了克服这种局限性，2014年Philimonenko V V等[31]开发了一组新型的形状编码的金属纳米颗粒，可以结合到抗体与其他生物大分子上。将这些形状作为基础的纳米粒子，结合市售的黄金纳米粒子，结果显示,通过电子显微镜第一次可以同时检测5个分子靶点。正是由于其具有操作快速而简单，数分钟即出结果,不需要仪器，操作人员不需要特殊训练，试剂稳定等优点。所以非常符合临床应用，得到了飞快的发展。目前，还没有市场化检测流产衣原体的免疫胶体金产品。

3.3 衣原体分子生物学诊断

随着分子生物学不断地发展以及人们对流产衣原体基因组研究的不断深入。衣原体分子生物学诊断也因其特异性、准确性和敏感性高，而被广大学者所认同。目前用于构建衣原体分子生物学检测技术的靶基因主要包括衣原体16 S-23 S rRNA 基因和主要外膜蛋白(MOMP)[32]。

3.3.1 基因探针检测法 基因探针原理是利用DNA-RNA杂交技术检测衣原体的RNA。已经有上市的商品化试剂盒Gene-Probe，但由于其试剂造价昂贵，很少被国内实验室所采用，仅在国外实验室应用。基因探针的敏感性与操作良好的细胞培养法具有相同的敏感性[33]。但由于其操作步骤繁琐,逐渐被核酸扩增技术替代。

3.3.2 聚合酶链反应 1985年，美国科学家Mullis K发明了聚合酶链反应(ploymerase chain reaction，PCR)。从此，PCR得到了生命科学界的普遍认同。国内外学者对衣原体的PCR检测技术进行了许多探讨。张莉等[34]根据羊流产衣原体16 S rRNA基因保守序列，扩增出523 bp基因片段，而沙眼衣原体、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及健康鸡胚的卵黄囊膜均未扩增出相应的片段。PCR已经成为检测衣原体的常见手段之一。

3.3.3 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR ( real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。Okuda H等[35]采用SYBR Green实时荧光PCR检测鹦鹉热衣原体，该文章的实时荧光定量PCR引物分析还适用于流产衣原体和猫衣原体。Jorge G等[36]采用双重荧光定量PCR检测流产衣原体，试验验证本方法是一种灵敏快速的检测工具，具有用于绵羊流产常规诊断方法的价值。

3.3.4 环介导等温扩增 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)依赖的是一种具有链置换特性的BstDNA聚合酶(Bacillus stearothermophilus DNA polymerase)和4条能够识别靶序列上6个特异区域的引物。靶序列的扩增反应需要在等温条件下进行约1 h。杨军[37]针对衣原体共有保守特定区域设计通用的2对基因的内、外引物和1对环引物，成功建立起了衣原体的通用LAMP。该方法具有易操作、准确率高、设备要求低、结果易判断等优点。适用于大批量临床标本材料的大批量检测。

3.3.5 DNA微阵列 DNA微阵列(DNA microarray),又称基因芯片，该技术系指将大量的探针分子固定于载体上后与标记的待测样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度从而获得待测样品分子的数量和序列信息[38]。现已经有商品化检测流产衣原体的DNA微阵列产品。Borel N等[39]应用DNA微阵列技术对339份临床样本进行了检测，结果显示，此技术适用于流产衣原体的临床检测。Pospischil A等按照Borel的描述检测出塞伦盖蒂平原的野生哺乳动物存在流产衣原体的感染。现已经有商品化检测流产衣原体的DNA微阵列产品。Koschwanez M等应用商品化DNA微阵列产品检测猪流产胎儿，检测出了流产衣原体的存在。但该技术可以高通量的检测标本材料，但不能对待检测基因在多细胞类型组织中的精确定位进行判断。

3.3.6 限制性片段长度多态性分析法 作为第一代分子生物学标记的限制性片段长度多态性分析(restricted fragment length polymorphisms，RFLP)是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。Laroucau K等[40]应用RFLP成功区分了鹦鹉热衣原体1B疫苗株和野生株。Meijer A等[41]应用RFLP对肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体进行了鉴定。该技术结果可靠，操作稳定，但实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，不适于大规模的分子实验。

4 衣原体的防治

制定合理的饲养管理程序并严格执行是预防流产衣原体的首选方案。预防手段可以为养殖业挽回巨大的经济损失。当农场发生羊衣原体病时，可用四环素族抗生素注射治疗，也可将其混在饲料里。

4.1 衣原体预防

4.1.1 饲养管理 合理的饲养管理程序也是预防动物衣原体的有效手段之一。有调查数据显示,在对OEA农场进行的诊断中检测出了其他的流产性的传染源(弓形虫、弯曲菌、沙门菌和李斯特菌)[42]。这体现了农场饲养管理的漏洞与生物安全意识的薄弱。

农场应坚持自繁自养的原则，不引进发病地区的家畜，定期进行疫苗接种。当需要引种时，应采取隔离饲养，观察家畜无病理表现及衣原体检测阴性后才可混饲。加强农场检疫，及时检测并淘汰发病畜和阳性畜。病死畜、流产胎儿、污染物应无害化处理，污染场地进行彻底的消毒。

4.1.2 疫苗接种 20世纪70年代，我国学者杨学礼等研究羊衣原体病原特性和疫苗免疫机制。在青海从绵羊流产的病料中分离到衣原体，经过12年的不懈努力，最后研制成功了羊流产衣原体灭活苗。为控制我国羊流产衣原体病发挥了重要的作用。随后，中国农业科学院兰州兽医研究所研究人员进一步在抗原纯化、乳化工艺、佐剂选择等方面进行了很大的改进。在青海、甘肃、新疆等地推广改进后的疫苗，取得了很好的临床效果[43]。注射怀孕绵羊和山羊,均很安全,最小有效免疫量为1 mL；免疫持续期和有效保存期均在2年以上[44]。在国外，动物衣原体病的防控以弱毒疫苗为主。Rodolakis A等[45]利用物理诱变的方法获得了2株温度敏感型衣原体突变株，分别是耐受35℃的衣原体IB株和39.5℃的衣原体IH株。但弱毒疫苗可能在某些情况下会导致流产[10]。这是因为弱毒疫苗在某种情况下会发生毒力返强或变异。所以在使用预防OEA弱毒疫苗时要对疫苗进行充分的预防效力检测。流产衣原体感染的农场接种弱毒疫苗后，疫苗呈现出治疗的作用[46]。但该现象需要进一步的研究才能明确疫苗的治疗作用。

流产衣原体疫苗的免疫机制与人工感染处于恢复期的羊免疫机制相似[13]。 流产衣原体的体液免疫在接种疫苗羊和自然感染羊中均可被观察到，从而无法区分接种疫苗羊和自然感染羊[11]。未来成功的抗OEA的疫苗应该可以引发与保护性免疫相关的IFN -γ，并且可以区别于自然感染的抗体谱，不会引起疾病或过度的炎症反应。流产衣原体在绵羊细胞内建立持续感染的能力反映了适应宿主和病原体复杂相互作用。此阶段的感染引起的免疫反应显然不是保护性的，而产生的流产后的免疫反应是有保护性的。一个新的OEA疫苗的目标是模仿或改进这种保护性反应。

4.2 衣原体病的治疗

流产衣原体是OEA的病原且为革兰阴性病原体，现归属细菌范畴，所以抗生素治疗对其是有效的。如果感染发生在产羔季节早期，抗生素可以降低OEA的损失，尤其是在产羔季节特别有效的。但是由于兽药残留的问题，所以长期使用抗生素对OEA进行防治并不是一个理想的方法[47]。有研究发现，抗生素不能应用于接种活疫苗的羊群，否则会降低疫苗的免疫活性[47]。治疗措施不同于预防措施。虽然抗生素可以通过降低衣原体在群内的传播来减少传染，但是过度的依赖抗生素会产生耐药性，而且不符合现在的健康潮流。并且抗生素治疗的母羊在分娩期仍然会排出EB[7]。

现如今治疗措施的风险性重点在于抗生素的耐药性。虽然流产衣原体对四环素的耐药性并没有报道，但在猪体内分离到的猪衣原体已对四环素产生抗药性[48]。目前，流产衣原体在动物体内的耐药性依然很低，但是有研究发现了耐药性在选择性抗生素压力下点突变的积累进化[49]。现在公众十分关注食品链中的药品残留问题，长期使用抗生素的牲畜对消费者来说是巨大的健康问题。

抗生素治疗周期很长。正如前面提到的，衣原体持续感染是其常见特征之一。在实验诱导的体外也观察到复制缓慢的RB可以引起细胞内持久性感染[50]。混合性感染外加持续性慢性感染需要更长的治疗时间，甚至可能对抗生素治疗无效，这容易和遗传获得耐药性基因发生混淆[44]。现有研究称抗生素可能会引发免疫抑制，理由是抗生素限制感染的进展，降低免疫系统的防御能力，反过来会导致再次感染的机率上升[51]。 因此，应合理使用抗生素，杜绝滥用抗生素，寻找对衣原体敏感性高的抗生素并结合合理的治疗方案，延缓抗药性的产生。

5 小结

动物衣原体病近年来在我国流行较为严重，尤其是羊、奶牛、牦牛衣原体导致的流产，严重阻碍了养羊产业和养牛产业的进一步发展。我国科学家在20世纪80年代制备出衣原体相应的诊断试剂和灭活疫苗，为控制我国动物衣原体病的蔓延发挥了非常重要的作用。试验证明流产衣原体灭活疫苗可以为动物提供非常好的保护。但是鸡胚或细胞生产的方式不符合现在疫苗生产的工艺要求，无法达到产业化、机械化。因此，流产衣原体灭活疫苗的生产工艺还需进一步的改善。

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Progress onChlamydiaabortus

ZHANG Zhi-jun,ZHOU Ji-zhang

(StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology/LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Lanzhou,Gansu,730046,China)

Chlamydiaceae,a family of obligate intracellular Gram negative bacteria that once included one genus,Chlamydia.TheChlamydiaabortusis one of the most common pathogens that can threat sheep industry seriously.Chlamydia abortion can not only infecte sheep,but also can cause of sheep abortion,stillbirth,even can infect human being.In the aspect of etiology,molecular biology technology with its rapid and relative sensitivity advantages has been developed rapidly,however,cell isolation and culture are the gold standard for the diagnosis ofChlamydiaabortus.In the area of prevention,vaccine is an ideal measure to preventChlamydiaabortion.Chlamydiaabortusinactivated vaccine has obtained a national new drug certificate and can provide effective immune protection for sheep.Rational use of antimicrobials and vaccines can provide good protection for the sheep.

sheep；Chlamydiaabortus；diagnosis；treatment

2016-09-21

甘肃省科技支撑计划项目(1504NKCA054)

张志君(1993-)，女，河北衡水人，硕士研究生，主要从事动物疫苗及分子免疫学研究。

S852.852.67

A

1007-5038(2017)04-0102-06

*通讯作者