猪博卡病毒病原学和检测方法研究进展

汪 洋, 李 玲, 李 真，李 峰，2*

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600)



猪博卡病毒病原学和检测方法研究进展

汪 洋1, 李 玲1, 李 真1，李 峰1，2*

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600)

猪博卡病毒是2009年新发现的一种猪细小病毒，近几年来在我国感染率日益升高，且常常与其他病原混合感染，增加了疫病防控的难度。论文就猪博卡病毒病原学与检测方法做一综述，为提高我国猪博卡病毒的综合防控能力提供参考。

猪博卡病毒；病原学；检测方法

猪博卡病毒(Porcine bocavirus，PBoV)是一种新型的猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)，于2009年首次在患断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post weaning multisystemic wating syndrome,PMWS)的仔猪淋巴结中分离鉴定出来[1]，随后世界养猪密集地区陆续发现该病毒的感染，目前该病毒已呈世界范围内流行[2-5]。PBoV感染引起的临床症状与普通的PPV感染相似，仔猪的发病率和病死率高，成年猪的发病率和病死率较低[6-7]，近年来该病毒在我国猪群中感染情况呈逐渐上升的趋势[8]。PBoV是一种人畜共患病毒，该病毒不仅能感染猪，还可以感染牛和人，不仅给养猪业带来经济损失，还威胁人类健康，加强PBoV防控技术研究，对保障养猪业健康发展和公共卫生安全均至关重要。论文综述了PBoV病原学与检测方法的最新研究现状与未来发展趋势，旨在为我国PBoV防控措施的制定提供技术支持，进而逐步提高我国PBoV的综合防控能力。

1 猪博卡病毒的病原学

1.1 猪博卡病毒分类

猪博卡病毒属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒亚科(Parvovirinae)博卡病毒属(Bocavirus)，博卡病毒属成员包括牛细小病毒(Bovine parvovirus,BPV)，大猩猩博卡病毒(Gorilla parvovirus,GBoV)，犬细小病毒(Canine parvovirus,CnMV)，猪博卡病毒(PBoV)和人博卡病毒(Human parvovirus,HBoV)[9]。PBoV为单股DNA病毒，病毒基因组全长5.2 kb，正二十面体结构，无囊膜，病毒粒子大小为25 nm～30 nm[10]。国际病毒分类委员会(ICTV)根据PBoV非结构蛋白NS1的核苷酸同源性将猪博卡病毒分为5个基因型(PBoV1-5)[11]，目前，5种基因型的PBoV在猪体内都有发现，PBoV1首先在瑞典患多系统衰竭综合征病猪体内发现，PBoV2在美国感染猪圆环病毒猪体内发现，PBoV3、PBoV4在中国健康猪群粪便中发现，PBoV5在香港腹泻仔猪粪便中发现[12]。

1.2 猪博卡病毒基因组结构和功能

PBoV与CnMV核苷酸同源性最高，为52%～55%，其次与GBoV核苷酸同源性为50 %，与HBoV核苷酸同源性为44%～48%，与BPV核苷酸同源性为44%～45%[13]。PBoV基因组为单股线状DNA，全长4786 bp～5905 bp，5种基因型的PBoV基因组结构基本一致，基因组序列从5′端依次含有ORF1、ORF2、ORF3 3个主要的开放阅读框[14-15]。其中，ORF1全长1 911 bp，编码636个氨基酸，ORF1编码非结构蛋白NS1，是与病毒的滚环复制方式、解螺旋酶活性及三磷酸腺苷酶活性相关的一段保守序列[16]。ORF2全长657 bp，编码218个氨基酸，ORF2编码衣壳蛋白VP1、VP2，VP1序列内含有与病毒感染性有关的磷脂酸序列，VP1、VP2是病毒的主要抗原性基因[17-18]。ORF3全长1 872 bp，编码623个氨基酸，ORF3是病毒特有的开放阅读框，编码非结构蛋白NP1[19]。

1.3 猪博卡病毒流行病学

PBoV自2009年被首次发现和报道后，在短短几年的时间内，关于PBoV感染方面已经有大量报道，更有发生PBoV与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)混合感染的报道。PBoV在当前猪群中感染十分普遍，侯美如等[20]的统计表明,5种基因型的PBoV在临床中都有发现，PBoV1和PBoV3感染的阳性率最高，分别为39.3%～63.2%和12.59%～64.4%。PBoV4感染的阳性率为16.5%，PBoV2 的感染阳性率为0.76%～6.6%，PboV5感染率相对较低。PBoV对各种消毒剂敏感，常用的消毒剂都有一定的杀灭作用，PBoV在秋末和早春寒冷季节多发，病毒可以通过消化道、呼吸道接触传播，也可以通过血液和胎盘垂直传播[21]。PBoV感染可以引起支气管炎、肺炎和胃肠炎，母猪感染引起流产，产死胎和木乃伊胎，感染仔猪发生呕吐、腹泻，病猪严重消瘦，精神沉郁，最后发生严重脱水而死亡，剖检可见肠壁变薄、充血和出血[22]。

2 猪博卡病毒的检测方法

PBoV感染后的临床症状与PPV感染的临床症状极其相似，且PBoV常与PRRSV、PCV2、PRV等病毒混合感染，增加了PBoV临床诊断的难度，对于PBoV感染的确诊需借助实验室诊断技术。随着分子生物学和免疫学的快速发展与其在动物疫病诊断中的推广应用，PBoV的分子生物学与血清学检测方法亦得到了快速发展与完善。

2.1 聚合酶链反应

聚合酶链反应(PCR)操作简单、检测快速、敏感、特异，适合于基层实验室进行PBoV感染的快速诊断与流行病学调查等，是一种值得基层推广应用的快速诊断技术。付朋飞等[23]根据GenBank中登录的PBoV1/2型的高度同源保守序列设计1对特异性引物，经PCR扩增条件优化，建立了检测PBoV1/2型的PCR方法。该方法可以从PBoV1型或2型的阳性样品中特异性的扩增出751 bp的目的片段，而对PRV、PCV2、大肠埃希菌、沙门菌核酸样品的检测均为阴性，对PBoV1/2重组质粒标准品的最低检测限为34.8 copies/μL，为PBoV1/2型的诊断和监测提供了技术支持。同时，付朋飞等[24]建立了可同时扩增出PBoV3/4/5型的PCR检测方法，为PBoV3/4/5型的快速检测提供了有效的技术支持。胡军勇等[25]根据PBoV NS1基因序列设计1对引物，建立了PBoV的PCR检测方法，该方法可以特异性的扩增出482 bp的片段，对PBoV的最低检测量为213.6 copies，利用该检测方法对湖北、湖南、河南等省的各大猪场进行了流行病学调查，在79个规模化猪场采集的248份病料样品中有172份样品为PBoV阳性，PBoV在腹泻猪群中的阳性率达到73.95 %，表明PBoV在国内猪群中流行广泛而且感染率高。翟少伦等[26]也建立了PBoV的PCR检测方法，通过对2009年我国部分省市猪场的191份临床样品进行检测，结果75份为猪博卡病毒阳性，表明我国猪群中PBoV相当流行，该PCR可以作为PBoV临床诊断上的一种诊断技术。

2.2 多重PCR

多重PCR是在同一PCR反应体系中，加入多对特异性引物，实现两种或多种病原核酸的检测，广泛用于各种临床疾病的快速诊断和分型研究。宏春慧等[27]根据PBoV基因序列分别设计3对针对PBoV 1型、2型和3型3种基因型保守区域的引物进行PCR扩增，扩增目的片段大小分别为645 bp(PBoV1型)、352 bp(PBoV2型)和259 bp(PBoV3型)，建立了PBoV不同基因型三重PCR检测方法，该方法最低检测限为8×10-7ng/μL，对临床样品进行三重PCR和单项PCR检测，二者符合率为100 %，该方法的建立为PBoV 3种不同基因型的鉴别检测提供了有效手段。李小鹏等[28]利用同源性分析设计3对引物分别扩增PboV1、PBoV2、PBoV3，也建立了PBoV多重PCR检测方法，实现了PBoV快速多基因型检测。蔡雨函等[29]根据PBoV1/2型和PBoV3/4/5型的基因组序列，分别设计扩增PBoV1/2型和PBoV3/4/5型的检测引物，在建立单一PCR检测方法的基础上，通过反应条件的优化，建立了PBoV1/2/3/4/5型的双重PCR检测方法，应用本方法对189份仔猪腹泻病料进行了检测，结果共检出PBoV阳性样品121份，阳性率达到64.2%，121份阳性样品中有79份为PBoV 3/4/5型，29份为PBoV 1/2型，13份为PBoV 1/2型及3/4/5型混合感染，表明四川地区主要的流行毒株可能是PBoV 3/4/5型。

2.3 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR是结合常规PCR技术和光谱技术发展起来的一种新型分子生物学定量检测技术，与常规PCR相比具有敏感性更高、全封闭反应、不需核酸电泳检测、实时定量等优点。陈鹏强等[30]建立了PBoV5型SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR，该方法在3.64×102copies/μL～3.64×107copies/μL范围内有很好的线性关系，扩增产物的熔解曲线仅出现单一特异峰，无引物二聚体，Tm值为83.12℃±0.12℃，可重复性好，组内变异系数为0.35%～1.24%，组间变异系数为0.43%～1.46%，此方法的建立为定量分析PBoV5型感染猪的感染程度和靶器官提供了精确检测手段。邓波等[31]根据PBoV序列，通过VP1/2基因设计引物和TaqMan探针，建立了检测PBoV的实时荧光定量PCR，该方法检测PPV、PRRSV、PCV2均为阴性，具有较高特异性，在107copies/mL～101copies/mL模板范围内具有良好的线性关系，所制作的标准曲线相关系数为0.997，最低可检测到101copies/mL的阳性质粒，所建立的PBoV实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性好和精确性高等优点。荧光定量PCR的灵敏度虽高，但该方法对仪器设备和操作人员技术水平要求较高，一般基层实验室由于不具备实验条件而无法开展。

2.4 环介导等温扩增

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新型核酸扩增技术，该技术通过应用多条特异性引物和具有链置换功能的DNA聚合酶可以实现等温扩增，不需要特殊的仪器设备，操作方法简单，肉眼判读结果，更加直观，方便。李帅伟等[32]应用DNA Star生物学软件对GenBank中PBoV进行同源性分析，获得PBoV保守靶序列，根据保守序列设计4条特异性引物，经LAMP反应条件的优化，建立了检测PBoV的LAMP检测方法，并组装了试剂盒，该试剂盒检测猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus,PEDV)、轮状病毒(Rotavirus,RV)、PRRSV、PCV2、PPV均为阴性，可以检测到10-6倍稀释的PBoV阳性病料核酸DNA，实现了PBoV的体外快速诊断，该研究成果已经申请国家发明专利。LAMP方法操作简单、检测快速，不需要昂贵的实验仪器，适合在基层临床疫病诊断中推广应用。

2.5 间接免疫荧光

间接免疫荧光方法以荧光物质标记抗体，通过抗原抗体的特异性结合，是用荧光抗体检测相应抗原的方法。McKillen J等[33]利用猪原代肾细胞建立了PBoV的原代细胞培养方法，通过间接免疫荧光试验判定病毒在细胞上的增殖情况，PBoV可以在猪原代肾细胞上生长复制并主要存在于猪原代肾细胞的细胞核中。间接免疫荧光方法根据抗原抗体特异性反应原则，特异性强，敏感性高，但需要细胞培养等无菌操作较严格的实验技术，操作复杂、繁琐，专业人员需要一定的技术水平，一般基层实验室很难具备试验条件。

2.6 酶联免疫吸附试验

郑英帅[34]分别对NP1基因和VP2基因进行B细胞线性抗原表位的预测分析，设计合成特异性引物，采用降落PCR技术扩增NP1基因和截短的VP2基因，并分别将其与原核表达载体pET32a连接，经IPTG诱导后SDS-PAGE电泳可分别检测到分子质量约为44 ku和35 ku的蛋白，重组蛋白纯化后经Western blot结果显示，NP1和VP2重组蛋白均与PBoV阳性血清具有良好的反应原性，分别以纯化的两种重组蛋白作为包被抗原，通过对各自反应条件的优化，分别建立了检测PBoV NP1抗体和VP2抗体的间接ELISA检测方法，NP1-ELISA和VP2-ELISA检测CSFV、PRRSV、PPV、PCV2阳性血清均为阴性，批内和批间重复性试验的变异系数均值都小于10%，临床样品检测表明NP1-ELISA比VP2-ELISA的检出率高，VP2-ELISA为PBoV感染的快速诊断与流行病学调查等提供了一种简便、快速、高通量的血清学检测方法。ELISA简单、快速、敏感、特异、稳定性好，非常适用于大批量样品的检测，具有良好的应用前景。

3 小结与展望

国内的现阶段流行病学调查证明PBoV的感染情况，无论在健康猪群还是表现呼吸道以及腹泻症状的猪群中都有很高的阳性率，PBoV值得关注和持续化监测[35]。目前PBoV防控还没有疫苗可以应用，养猪场防控本病主要通过加强饲养管理和加强环境卫生，定期做好疫病监测，及时发现病情，及早隔离病猪。在PBoV的各种诊断方法之中，PCR和多重PCR简单、快速，但该方法敏感性低于荧光定量PCR、LAMP等，容易出现漏检。荧光定量PCR弥补了常规PCR不能定量的缺点，且其敏感性大大提高，但该方法对仪器、试剂、操作人员的要求均较高，限制了在基层兽医部门的推广应用。LAMP是新兴的分子生物学检测方法，对仪器、试剂、操作人员的要求较低，特别适合基层兽医部门适用，但敏感性太高，易导致假阳性结果。ELISA操作简单、高通量，将是PBoV血清学抗体监测的主要方法，具有广阔的开发应用前景。综合判断，PBoV的各种监测方法均具有各自的优缺点，检测人员可根据自身实验条件选择适合的方法。相信随着分子生物学和血清学技术的不断发展，PBoV的各种检测方法亦会得到不断完善，同时也会有更多的新型检测方法不断建立，不断为PBoV的诊断、流行病学调查和防控提供技术保障。

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Advance in Etiology and Detection Methods of Porcine Bocavirus

WANG Yang1,LI Ling1,LI Zhen1, LI Feng1,2

(1.ShandongLvduBio-SciencesandTechnologyCo.Ltd.,Binzhou,Shandong,256600,China; 2.ShandongBinzhouAnimalScienceandVeterinaryMedicineAcademy,Binzhou,Shandong,256600,China)

Porcine bocavirus is a swine parvovirus recently discovered.In recent years the infection rate was increasing in China,and often mixed infection with other pathogens,thus increasing the difficulty of disease prevention and control.This paper makes a review on the etiology and detection methods of porcine bocavirus,in order to provide reference for improving the comprehensive prevention and control of porcine bocavirus in China.Key words:Porcine bocavirus;etiology;detection methods

2016-10-08

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队建设任务项目(SDAIT-08-17)

汪 洋(1973-)，男，安徽人，硕士，主要从事预防兽医学研究。

S854.43;S852.659.2

A

1007-5038(2017)04-0098-04

*通讯作者