水貂阿留申病诊断抗原研究概述

于 凯，倪 佳，冯二凯,3，万洪理，陈立志,3*

(1.吉林农业大学，吉林长春 130118；2.吉林特研生物技术有限责任公司，吉林长春 130122；3.中国农业科学院特产研究所，吉林长春 130122)



水貂阿留申病诊断抗原研究概述

于 凯1,2，倪 佳2，冯二凯2,3，万洪理2，陈立志2,3*

(1.吉林农业大学，吉林长春 130118；2.吉林特研生物技术有限责任公司，吉林长春 130122；3.中国农业科学院特产研究所，吉林长春 130122)

近年来，随着水貂养殖行业的不断发展，一些疫病也成为了制约水貂养殖业发展的重要因素。水貂阿留申病作为毛皮动物的三大疫病之一(阿留申病、犬瘟热、病毒性肠炎)，是导致母貂产仔率下降、公貂配种能力降低和毛皮质量下降的一种高度接触性传染病。至今为止，还没有商品化的疫苗来控制该病的传播及蔓延。控制水貂阿留申病最好的方法是通过检测淘汰所有抗体为阳性的水貂，进而达到净化貂群的目的。而在抗体检测过程中，诊断抗原的制备和纯化决定着检测方法的敏感性、特异性和准确性。论文对目前阿留申病毒细胞抗原及基因工程抗原研究进展做一综述，为今后该病病原检测工作提供参考。

水貂阿留申病；诊断抗原；VP2基因；对流免疫电泳

水貂阿留申病(Mink Aleutian disease，AD)是由细小病毒科阿留申病毒属的阿留申病毒(Aleutian disease virus，ADV)引起的一种高度接触性传染病，主要侵害水貂的免疫系统，引起免疫抑制[1]。AD在很大程度上是由于血液中anti-ADV抗体增加，抗原和抗体形成的复合物在多个组织器官内沉积而引起炎症[2]，AD是一种免疫复合物疾病[3]，可导致母貂的繁育能力降低、空怀和仔貂的死亡。由于AD发病急、传播快、危害大，使得控制该病已经成为国际性的难题[4]。由于其特殊的致病机理，目前没有有效的防控手段，因此需要依靠检测方法来根除该病对貂群的危害。而AD的诊断不仅要依据临床症状及体征，还需要应用实验室检测的方法来得以确定。因此，检测抗原的制备尤为重要，研发和制备抗原对阿留申病的检测具有重要的临床意义。

1 脏器抗原

最初在缺少水貂阿留申病毒毒株和生产工艺还不完善时应用的一种抗原。1969年Porter D D等[5]最先以感染ADV的水貂肝脏研磨液通过离心制备抗原，将其人工接种于健康水貂，接种9 d后可检出ADV抗体，虽然感染两个月后通过间接免疫荧光技术测得其抗体效价可达到1∶100 000。但是该项技术步骤繁琐，重复性不高，不适用于实践生产；Cho H J和 Ingram D G[6]以被感染水貂的脾、肾和肝为抗原，利用对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis，CIEP)技术，检测血清中的ADV抗体。检测结果表明水貂在感染ADV约9 d～11 d后便可检出抗体为阳性，该检测技术特异性较强，重复性高，与剖检的符合率可达100%，但是敏感性较低，仅为75%；日本学者Shimizu Y等[7]从慢性感染ADV的貂体内采集脾脏，经过一系列离心、纯化、浓缩后，首次使大批量制备阿留申诊断抗原成为了可能，但是方法过于繁琐，且散毒风险大，不耐贮存和冻融，所以至今未被采用；关中湘等[8]从我国辽宁省金州貂场分离1株被感染的水貂“辽金ADV81-02”病毒株，以人工感染的方式对8月龄的健康水貂进行攻毒试验，在攻毒后第9天，从急性感染的病貂体内取出淋巴结、肝脏、脾脏进而用氟碳提取并纯化，经过超速离心浓缩后，用盐酸-甘氨酸活化，得到检测ADV的抗原，但在制备抗原过程中，提纯需要14个步骤和26次化学处理，前后需1周时间，试验中需要昂贵的氟碳提纯，这不仅增加了制备抗原的成本，同时也破坏了抗原的理化性质，致使稍一冻融，抗原就会失效，同时脏器抗原需对多个水貂进行攻毒才可获得大量抗原，因此这种方法不便应用于实际生产；与此同时，美国浓缩的脏器抗原，在不经过反复冻融的情况下，4℃仅保存1周，如稀释成工作液后，4℃保存2 d就已失效，所以在应用过程中有诸多不便，也未得到推广。

2 细胞抗原

随着科研成果的不断创新，各国的学者将目标转向了体外培养病毒，20世纪80年代丹麦首先研制出体外培养病毒抗原，采用传代细胞进行病毒的扩增，而传代细胞成分单纯，工艺先进，代表了阿留申诊断抗原研制的新水平[9]。但是在制备纯化过程中离不开超速离心，这在很大程度上阻碍了其推广与普及。随着对AD诊断抗原的不断研究，我国学者李增光等[10]比较了各国抗原制备的优点，用猫肾传代细胞(CREK)和AMV国际抗原标准株Utah-1，经过多次的试验，以最新的生产工艺，在我国首次成功研制出诊断AD的传代细胞抗原，其工艺简单，不受动物来源及季节的限制，可随时生产，且反复冻融后也可保持其检测能力；吴威等[11]用CRFK细胞培养ADV-G株病毒，收集病变的细胞，离心处理后得到诊断AD CIEP的细胞抗原，通过酶印记证明该抗原的分子质量及纯度和美国细胞抗原相一致，其灵敏性还高于美国细胞抗原，而且该抗原稳定性好，可长久保存，沉淀线清晰，易于观察，不需要宰杀动物，实现了体外病毒检测的可能，至今在CIEP检测工作中仍占据重要的地位。

3 基因工程抗原

分子生物学技术已经成为快速发展的研究领域并具有工业生产蛋白质的潜力[12]。目前应用基因工程技术进行体外表达目的蛋白，使重组蛋白的大规模生产和应用成为了可能。已有研究表明，AD抗体检测技术中的诊断抗原从最初的ADV-G株的细胞抗原，正逐渐变成现在通过基因工程技术获得的基因工程抗原VP2蛋白，由于VP2基因占整个ADV衣壳蛋白的90%，成为ADV最主要的免疫原性蛋白，更是抗原决定簇载体，从而国内外许多学者通过克隆VP2基因，成功表达具有免疫原性的抗原[13]。由于其具有良好的免疫原性，因而在检测结果的灵敏性和特异性上都得到了明显的进步。因此，利用基因工程技术获取CIEP抗原成了研究的重点。

3.1 原核表达系统的抗原

原核表达系统是目前最常用的外源基因表达系统，也是研究最透彻且最经济实惠的表达系统，以大肠埃希菌为代表的原核表达系统是外源重组基因表达的首选[13]。曾祥伟等[15]利用原核表达载体PMAL-C2对ADV的VP2基因主要功能区进行原核表达，将表达的蛋白纯化后作为诊断抗原，建立了VP2-CIEP的诊断方法，与细胞抗原相比，具有较高的敏感性和特异性，其符合率高达94.3%；徐磊等[16]通过PET-28a(+)及PMAL-P2X载体对ADV的VP2基因上主要两段抗原区进行原核表达，将表达产物作为标记抗原，初步建立了水貂AD胶体金免疫层析诊断方法[17]，该诊断方法与CIEP比较，其敏感性是CIEP方法的2倍，同时与其他非ADV的阳性血清无交叉反应，说明其特异性好；李艳伍[18]利用PET-28a(+)载体对AMV-VP2主要功能区进行原核表达，对表达的蛋白纯化后包被抗原进行间接ELISA抗体检测，通过与CIEP法对120份血清样品比较符合率达95.8%，证明了该方法特异性好，敏感性高，可以将表达的产物应用到抗体检测中；黄盼盼[19]以ADV美国株ADV-G结构蛋白VP2为研究对象，通过预测B细胞抗原表位及筛选保守序列，人工合成保守性高的SD序列，通过大肠埃希菌表达系统诱导表达，获得了可溶性SD蛋白。这种全新的人工抗原SD蛋白作为一种检测抗原具有良好的反应原性，将SD蛋白作为包被抗原成功的建立了间接ELISA抗体检测方法，其方法具有重复性好、特异性强及敏感性高的特点，与CIEP检测方法比较符合率较高；李晶[20]将ADV的VP2基因克隆至载体PGEX-4T-1中进行原核表达，将纯化的重组蛋白作为包被抗原成功的建立了ADV的Dot-ELISA检测方法，该方法与CIEP 同时对78份临床血清样品进行检测，结果表明Dot-ELISA阳性检出率为84.6%，CIEP阳性检出率为80.8%，其敏感性高于CIEP，两者符合率为96.2%；Chen X等[21]通过PMAL-C2X载体对AMV VP2截短基因进行原核表达，通过对表达的蛋白进行ELISA抗体检测，其特异性和敏感性分别达97.9%和97.3%。而通过Western blot检测，其特异性和敏感性分别为86.4%和91.7%，虽然低于ELISA抗体检测方法，但也说明了重组蛋白及检测方法具有可行性。

3.2 真核表达系统的抗原

真核表达系统及相关技术为工业化生产蛋白提供了技术平台，由于该系统的不断完善及进步，成千上万种重组蛋白被研制成功，对学术界及工业领域具有重要贡献。真核表达系统已经成为最有效的体内表达蛋白的工具之一[22]，这使许多重组蛋白得到有效和高水平表达成为了可能，由于该系统具有翻译后修饰的特性，其合成蛋白的反应原性和免疫原性都与天然蛋白相似，因此在科研领域中得到了广泛的应用。Clemens D L等[23]用重组牛痘病毒VV:ADSP表达了AMV的自组装病毒样粒子(VLP)，对结构蛋白VP1和VP2进行表达，该表达产物可产生中和抗体，病毒结构与参考毒株ADV-G极为相似，用重组表达蛋白作为CIEP抗原检测健康及患病水貂的血清，其敏感性高于细胞抗原。Christensen J等[24]利用腺病毒载体系统成功表达了ADV的结构蛋白，将表达的产物用于CIEP检测，这不仅避免了散毒的风险，同时也不会污染健康水貂群，但由于重组蛋白的纯化及成本等方面的限制，目前局限于试验研究，尚未推广应用。Wu W H等[25]用杆状病毒表达了AMV的VLP，在Western blot中与CIEP效价小于4的多份血清进行比较，证明其具有良好的反应原性，通过CIEP方法证实其抗原性比商品化抗原更敏感，证明了重组的VLP可以作为诊断ADV的抗原。Knuuttila A等[26]用昆虫杆状病毒表达了重组VP2蛋白，形成了自组装VLP，纯化后作为CIEP诊断抗原检测209份水貂血清，与商品化抗原符合率达100%。对表达的蛋白进行ELISA抗体检测，该诊断方法的敏感性和特异性分别为99%和97%，完全可以代替细胞抗原，而且没有散毒风险，因此在芬兰被逐渐推广应用。王振军等[27]将ADV-G的VP2基因克隆到杆状病毒转移载体中，并成功转染到昆虫细胞Sf9中，获得了重组杆状病毒，通过Western blot、CIEP、免疫荧光的方法证明了该方法具有重复性好、敏感性高、特异性强的特点，表达的蛋白和商业的细胞抗原在检测方面具有高度的一致性。张蕾等[28]通过昆虫杆状病毒对AMV VP2基因表达，其中每10 mL培养液可产生1 mL抗原，比常规方法生产率提升了4倍；同时通过CIEP比较，两者的符合率达100%。

4 展望

随着对基因表达调控机理的深入研究探索和生物科学领域的快速发展，目前常用的表达系统都将得到进一步的应用和完善，同时人们相信在不久的将来，会有越来越多的表达系统诞生，但有些表达系统自身也存在很多缺点，所以要综合考虑各方面因素来选择合适的表达系统。例如在表达生物活性蛋白或构建基因疫苗时，真核表达系统是最佳的选择。它可以确保二硫键的形成及对表达蛋白进行磷酸化、糖基化、信号切割等修饰，从而使表达的重组蛋白生物学活性更接近天然蛋白。虽然重组蛋白很容易表达，但是蛋白的结构及特性会发生一些改变；在重组蛋白的水平上，细胞内、外表达和跨膜转运到细胞中进行表达是不一样的[29]，虽然真核表达系统对外源基因可有效表达，但表达水平差异很大，例如细胞种类、活力、培养基质量、培养环境和外源基因本身的特性等都可影响其表达量。反之原核表达系统可以提供用于诊断的人工抗原并对不需要翻译后修饰的蛋白进行结构分析，而且具有表达量高、成本低廉、操作简单、抗污染能力强等优点，至今已在各个领域中被广泛应用，但原核表达的重组蛋白多以非天然状态折叠致使重组蛋白活性较低，同时外源基因在重组过程中容易缺失及表达的蛋白易以包涵体形式存在，所以提高蛋白质产量需要优化基因的转录效率、提高翻译速度及确保稳定的mRNA。因而在选择表达系统时，需要充分考虑多种因素，如最佳表达的有机体，最适宜的生长环境，所需要表达的蛋白是否具有可溶性、安全性及天然活性。因此，在实践和科研探索过程中需要谨慎的做出选择。相信随着生物学、蛋白质组学及分子生物学的飞速发展，更多的表达系统将会不断产生，终会获得表达量更大、活性更好的重组蛋白。

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Summary of Diagnostic Antigens of Mink Aleutian Disease

YU Kai1,2，NI Jia2，FENG Er-kai2,3，WAN Hong-li2，CHEN Li-zhi2,3

(1.JilinAgriculturalUniversity，Changchun，Jilin,130118，China；2.JilinSpecialResearchBiologicalTechnologyCo.LTD.，Changchun，Jilin,130122，China；3.InstituteofSpecialWildEconomicAnimalandPlantScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Changchun，Jilin,130122，China)

The mink breeding industry has developed rapidly in recent years.Some epidemic diseases become the key factor restricting mink breeding development. Mink Aleutian disease,as one of the three main epidemic diseases (Mink Aleutian disease,canine distemper,virus enteritis) of fur-animals,can lead to decrease the reproductive performance and the quality of furs.It is a highly contagious disease.So far,there is no commercially available vaccine to control the spread of the disease.The best way for controlling Mink Aleutian disease is to detect and eliminate the minks whose antibody is positive,and achieve the purpose of purifying the mink crowds.During the process of antibody detection,the preparation and purification of diagnostic antigens determine the sensitivity,specificity and accuracy of detection methods.This article reviewed the advances on genetic engineering antigens and cell antigens of Mink Aleutian disease virus for providing references for Mink Aleutian disease detecting.

Mmink Aleutian disease；diagnostic antigen；VP2gene；CIEP

2016-09-13

横向课题(201300001);吉林省科技攻关计划项目(20150204073NY)

于 凯(1991 -)，女，内蒙古呼伦贝尔人，硕士研究生，主要从事特种经济动物疫病研究。

S852.659.2;S858.92

A

1007-5038(2017)04-0116-04

*通讯作者