牛传染性鼻气管炎诊断方法研究进展

张 芳，刘瑞宁，陈颖钰，郭爱珍

(华中农业大学农业微生物国家重点实验室/华中农业大学动物医学院,湖北武汉 430070)



文献综述

牛传染性鼻气管炎诊断方法研究进展

张 芳，刘瑞宁，陈颖钰，郭爱珍*

(华中农业大学农业微生物国家重点实验室/华中农业大学动物医学院,湖北武汉 430070)

牛传染性鼻气管炎(IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)，即牛疱疹病毒1型(BoHV-1)所引起的以上呼吸道炎症为主的一种牛的急性、热性、接触性传染病，呈世界性流行。IBR的早期准确诊断，对该病的防控具有不可忽视的作用。目前，IBR的诊断方法主要包括病原学诊断和血清学诊断方法。病原学诊断具有特异和敏感及准确等特点，而血清学诊断具有敏感、快速、方便和价廉等特点。为了实施IBR的净化和根除计划，部分国家和地区已逐渐采用IBR基因缺失疫苗，配套使用鉴别诊断方法来鉴别IBR疫苗免疫和自然感染。论文就牛传染性鼻气管炎常用诊断方法的研究进展进行综述，以期为IBR的诊断和防控提供参考。

牛传染性鼻气管炎；牛疱疹病毒1型；诊断；疫苗

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)，即牛疱疹病毒1型(Bovine herpesvirus-1，BoHV-1)所引起的牛的急性、热性、接触性传染病，又称为“坏死性鼻炎”、“红鼻子病”或牛媾疫。本病于1955年在美国科罗拉多州育肥牛体内被首次发现，随后在洛杉矶和加利福尼亚等地相继发现，并被命名为IBR。1956年，Madin S H等[1]首次从患牛分离出IBRV，Huck等于1964年确认IBRV属于疱疹病毒。此后证实，该病呈世界性流行。该病被世界动物卫生组织(OIE)列为必须通报的疫病之一，在我国被列为二类动物疫病，并列为进出口牛、牛遗传物质及肉制品的必检项目。

从该病发现到至今，关于IBR的诊断方法迅速发展起来，在实际生产中结合流行病学和临床检查对本病做出初步诊断，然后根据实验室的诊断方法对本病做出确诊。实验室的诊断方法主要包括病原学诊断和血清学诊断。近年来BoHV-1基因缺失标记疫苗的使用逐渐增加，如一些欧洲国家使用的BoHV-1 gE缺失疫苗。基因缺失疫苗不仅毒力较低，而且具有免疫标识，可区分IBR疫苗免疫和自然感染。鉴别诊断方法的配套使用，有利于IBR的检疫和防控[2]。

1 临床诊断

牛体感染BoHV-1后，机体会呈现出相应的临床症状，主要表现为高热、鼻和气管黏膜炎症、咳嗽和呼吸困难等，同时伴发有传染性脓疱性外阴-阴道炎、结膜炎、角膜炎，以及肠炎和小牛脑炎，并能引起母牛流产和死胎[3]。此外，BoHV-1是牛呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory disease complex，BRD)的病因之一，牛感染BoHV-1后，可引起免疫抑制，继发细菌感染以及其他病毒的感染，并引起严重的牛肺炎[4]。BoHV-1感染机体后会呈潜伏感染状态，它可以潜伏在三叉神经和腰、荐神经节内，并在应激条件下活化，并不断向外排放，所以潜伏带毒的牛可成为该病毒传播的重要传染源，这给该病的防控和净化带来了很大困难[5]。因此，临床上可以根据动物的临床检查和病理剖检等来对该病进行初步诊断，但是无法进行早期诊断和对疫病确诊，所以实际上还需要借助病原学诊断和血清学诊断等方法来对该病进行确诊，以便及时治疗和防控。

2 病原学诊断

IBR的病原学诊断方法主要包括病毒分离鉴定和分子生物学检测方法等，病原学诊断具有特异、敏感及准确等特点，其中分子生物学检测方法以核酸检测为基础通过检测特异性目标片段来对该病进行诊断，结果准确且特异，所以在实际应用中得到了广泛使用。

2.1 病毒分离鉴定

临床上，根据牛体不同的临床症状，采集的样品也会有所不同：鼻气管炎以棉拭子采集处于发热期的鼻液和眼分泌物；外阴-阴道炎时采集外阴部黏膜和阴道分泌物，公牛则采集精液和包皮的生理盐水冲洗物；有流产胎儿时采集胎儿胸水、心包液、心血及肺等实质脏器；脑炎时采集脑组织[6]。病毒分离鉴定主要是利用牛肾细胞(madin-darby bovine kidney，MDBK)对以上临床上采集的样品进行病毒分离和鉴定。样品感染MDBK后如果细胞产生圆缩、呈葡萄样聚集以及空洞等典型细胞病变，既可以诊断为BoHV-1感染[7]。但是，由于病毒分离过程比较复杂、耗时长、实验设备要求高等缺点，只能作为实验室诊断方法，因此在实际应用中很少应用。

2.2 病毒核酸检测

BoHV-1为DNA病毒，IBR核酸检测方法主要有聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和荧光PCR检测技术，此类方法通过一定的技术在体外对目标基因DNA片段进行快速扩增，然后根据结果进行疫病诊断。该方法与其他病原学检测方法和血清学诊断方法相比较，病毒核酸检测方法具有快速、高特异性和高敏感性等优势，因此在IBR的临床诊断上得到了广泛的应用。1993年，Vander、Vilcek和Wiedman等建立了BoHV-1的PCR诊断方法。此后，许多的学者研究并建立了BHV-1的核酸检测方法。王嵩等[8]根据GenBank中登录的BoHV-1保守基因gB序列设计了一对特异性引物，通过不断优化反应体系后建立了快速检测BoHV-1的PCR，该方法的检测敏感性可达10-3TCID50/mL。林梅等[9]建立了基于BoHV-1 tk基因的PCR检测方法，并对该PCR反应条件进行了优化，该方法敏感、特异，可为牧场进行IBR疫情监测提供有效技术手段。乔波等[10]利用BoHV-1 gB基因保守区域设计了特异性引物和MGB探针，建立了BoHV-1TaqMan-MGB荧光定量PCR，该方法灵敏、快速、特异性强、重复性好，适用于临床疑似样品的快速定量检测。Marin M S等[11]建立了高分辨率熔解曲线的荧光PCR，可以同时检测和区分BoHV-1和BoHV-5，该方法与病毒分离和传统PCR相比，具有更高的敏感性，是一种快速、敏感、特异的检测方法，可以广泛应用于BoHV-1的研究和诊断。

近年来，随着环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术的快速发展，与普通PCR相比较，该方法不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，因肉眼可以直接观察结果，所以大大的节省了时间。LAMP的原理是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件下(63℃左右)保温30 min～60 min，即可完成核酸扩增反应。我国皇甫和平等[12]针对IBRV 的gE基因建立了LAMP快速检测技术，为进一步开发针对gE基因缺失的IBRV疫苗鉴别诊断方法奠定了基础。印度的Pawar等建立了BoHV-1 gE的LAMP，在等温条件下就可以快速地检测和鉴别BoHV-1自然感染和BoHV-1 gE-疫苗株，大大提高了检测的灵敏度，是检测和鉴别BoHV-1自然感染及BoHV-1 gE缺失疫苗免疫的快速、敏感、特异、低成本的技术[13]。正因为LAMP具有简易、快速、高效率及高特异性等优点，所以 LAMP得到了广泛的应用[14]。

3 血清学诊断

3.1 中和试验

中和试验是IBR最常用、最经典的血清学诊断方法，是OIE规定的国际贸易指定的方法之一，同时也是我国动物检疫规定的方法[15]，适合于血清流行病学调查。中和实验的基本原理是将已知滴度的BoHV-1标准病毒与倍比稀释的待检血清中和后接种96孔板MDBK细胞，然后细胞培养一段时间，如观察到BoHV-1特异性细胞病变(cytopathic effect，CPE)，则说明该血清样品为BoHV-1中和抗体阳性，同时根据抑制50%接种细胞出现CPE的血清稀释度可计算血清的中和抗体滴度。

由于中和试验的过程繁杂，用时比较长，且容易受到其他不确定因素(细胞污染等)的影响，所以目前对于IBR的诊断该方法使用较少，在IBR的检疫中逐渐被酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)所取代。

3.2 ELISA

IBR ELISA是国际贸易中规定的诊断方法之一，因ELISA具有操作简便、快速、敏感、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用，在IBR的诊断和检测上发挥着举足轻重的作用。

构建BoHV-1抗体检测ELISA的靶抗原是具有免疫原性的囊膜糖蛋白。BoHV-1基因组有73个编码框(open reading frame，ORF)，可以编码73个蛋白质，且这些蛋白质的结构和功能大部分都已知。其中gB、gC、gD、gE和gG具有良好的免疫原性。因此，这些蛋白被作为IBR的诊断靶蛋白，用于建立IBR ELISA诊断方法。

gB糖蛋白是BoHV-1在细胞上增殖所必需蛋白，具有免疫原性，曹翀等[16]将纯化的gB蛋白作为诊断靶蛋白建立了gB间接ELISA，并证实其敏感性好，特异性强。虽然与糖蛋白gG和gD相比，gB的抗原性较弱，然而目前，已有商品化的gB阻断ELISA检测试剂盒，并得到了广泛的应用。

gC糖蛋白是感染细胞表面和病毒囊膜上表达量最大的糖蛋白，具有良好的免疫原性，是引起体液免疫和细胞免疫反应的主要靶标，马辉等[17]原核表达和纯化BoHV-1 gC重组蛋白，并制备了gC的特异性单克隆抗体及建立了BoHV-1双抗体夹心ELISA，该方法特异性和敏感性良好，为快速诊断IBR提供了诊断方法。

gD糖蛋白参与BoHV-1在细胞间的扩散，且是BoHV-1免疫原性最好的糖蛋白，能够诱导体液免疫和细胞免疫应答，常被作为亚单位疫苗的首选蛋白[18]。因其具有良好的免疫原性，周跃辉[19]表达和纯化BoHV-1 gD蛋白，并制备了gD的特异性单克隆抗体及建立了BoHV-1双抗体夹心ELISA，具有良好的重复性、敏感性和特异性，为我国的IBR流行病学调查提供了快速、简便的血清学诊断方法。

gE糖蛋白与病毒的顺行和神经毒性有关，同时具有免疫原性，是中和抗体的主要靶位点之一，已被作为诊断靶蛋白建立gE阻断ELISA诊断方法[20]，且市场上已有商品化的gE阻断ELISA检测试剂盒供应。同时，gE蛋白也是构建标记疫苗的靶蛋白之一，市场上已有商业化IBR gE缺失标记疫苗免疫和自然感染产生的血清抗体，即自然感染产生抗体，疫苗因缺失gE基因、不表达免疫gE蛋白，因此不产生gE抗体。此外，Bertolotti等利用gE重组蛋白建立的间接ELISA方法，该方法敏感性和特异性分别可以达到98.41%和99.76%，可以用于BoHV-1的血清学检测[21]。

gG糖蛋白也具有很强的抗原性，已被用于诊断抗原并建立了gG ELISA，试验证明效果良好。王冰[22]则以纯化的gG蛋白免疫小鼠得到单克隆抗体，并用辣根过氧化酶标记的单抗和表达蛋白建立了竞争ELISA，在牛传染性鼻气管炎流行病学调查方面具有重要的应用价值。

近年来，Elisabetta C等[23]建立了一个基于抗生物素蛋白-核酸的组装体(avidin-nucleic-acid-nanoassembly，ANANAS)技术的新型ELISA。ANANAS技术与传统的ELISA相比，最大的特色是由辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记抗体转变成了用生物素蛋白-HRP标记抗体，这是一种基于纳米颗粒级别的胶状多聚抗生物素蛋白新型的用于免疫诊断学的信号放大平台，可广泛应用于诊断程序中[24]。与传统的应用HRP的商品化ELISA试剂盒相比，Elisabetta等建立的ANANAS技术新型ELISA在不降低特异性的基础上提高了敏感性，具有很大的应用前景。

3.3 琼脂扩散试验

琼脂扩散试验是利用BoHV-1抗原来检测被检血清中的沉淀抗体，反过来也可以利用IBR阳性血清来检测临床病料或细胞培养物中的相应抗原。1993年，Suresh S建立了免疫扩散和对流免疫扩散检测BoHV-1的方法[25]。 该方法操作简单，成本较低，但是敏感性很低，不适用于BoHV-1的诊断和根除。

4 IBR根除计划与鉴别诊断

如前所述，一些IBR阳性率较高的国家或地区一般采用IBR gE基因缺失标记疫苗免疫以及联合使用剔除IBR gE阳性牛的措施来进行IBR的防控[6]。当牛群的IBR gE阳性率降低至5%时，就可采用扑杀的方法剔除剩下的阳性牛，以达到根除IBR的目的。除了IBR gE缺失标记疫苗外，一些欧洲国家也使用BoHV-1 gE-/tk-双基因缺失疫苗，该疫苗缺失了tk毒力基因，因此被认为是更安全的标记疫苗[26]。目前，BoHV-1三基因缺失疫苗也在不断研究和开发中。由于基因缺失标记疫苗与野毒相比缺失了一个或多个具有免疫原性的糖蛋白，因此基因缺失标记疫苗免疫并结合相应的诊断方法即可鉴别诊断IBR自然感染和相关疫苗免疫。

BoHV-1 gE缺失疫苗以活疫苗或灭活疫苗形式在欧洲已得到广泛的使用，与之配套使用的是IBR阻断gE-ELISA试剂盒，试验证明其可有效的区分BoHV-1自然感染牛和BoHV-1 gE缺失疫苗免疫的牛。邓碧华等[27]根据BoHV-1野毒株和BoHV-1 gE基因缺失疫苗株共有的BoHV-1 gB基因序列设计了一套引物，还根据缺失的BoHV-1 gE基因序列设计了另一套引物，并建立了检测BoHV-1的套式PCR，该套式PCR方法敏感性高、特异性强且操作方便，能够检测BHV-1及有效区分BoHV-1野毒株和BoHV-1 gE基因缺失疫苗株。Shafiqul I等[28]制作了缺失了UL49.5和gE胞质尾区的BoHV-1突变体，同时研制了一株针对BoHV-1 gE胞质尾区表位的单克隆抗体，并建立了gE胞质尾区的特异性阻断ELISA，可以成功区分野生型BoHV-1感染和BoHV-1突变体的感染。Claire O H等[29]通过高分辨率熔化分析(high-resolution melting，HRM)和PCR-DNA测序的方法来鉴别BoHV-1疫苗免疫株和BoHV-1感染后的突变株，因为BoHV-1疫苗免疫株和BoHV-1感染后的突变株有着不同的熔化曲线和不同的基因序列。BoHV-1感染牛后，gG蛋白可与体内趋化因子受体结合，通过封闭趋化因子作用而抑制免疫。因此，gG蛋白也是基因缺失标记疫苗的靶蛋白之一，本实验室Zhang M等[30]构建了BoHV-1 gG-/tk-双基因缺失疫苗，牛体试验表明疫苗毒力明显减弱，同时具有良好的免疫原性。所以，基于gG蛋白的鉴别诊断ELISA亟待建立，并应用于gG缺失标记疫苗的鉴别诊断。

5 结语

随着科学技术的发展，各国和地区规模化养殖业得到了发展和壮大，牛传染性鼻气管炎的流行和对养殖业的威胁也日趋严重。综上所述，虽然IBR的诊断方法多种多样，但是由于各自技术的特点，在不同的实际应用过程中，需要根据具体的实际情况选择适宜的诊断方法，以达到诊断目的。

自IBR被发现以来，对于该病的诊断方法在不断的革新和完善，传统的病毒分离方法周期长，费时费力，还很容易受到外界的影响。传统的核酸检测在近年来发展迅速，诊断技术形式也多种多样，灵敏度比较高，但是这些方法对仪器的要求非常高。LAMP克服了传统核酸检测的缺点，具有较好的应用前景。血清学诊断方法具有快速、方便等优点，但是对于潜伏感染的情况却难以诊断。新材料的发展推动了新的仪器和新的诊断技术的产生，IBR诊断朝着更加敏感、特异、快速、简便、高效的方向发展，配合标记疫苗的使用，将在IBR控制与净化根除中发挥重要作用，预防和控制IBR，并达到净化根除的目的。

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Progress on Diagnosis Method of Infectious Bovine Rhinotracheitis

ZHANG Fang,LIU Rui-ning,CHEN Ying-yu,GUO Ai-zhen

(TheStateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,HuazhongAgriculturalUniversity/CollegeofVeterinaryMedicine,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei,430070,China)

Infectious bovine rhinotracheitis (IBR) in cattle caused by infectious bovine rhinotracheitis virus(IBRV),also called as bovine herpes virus-1 (BoHV-1)can be an acute,feverish,and contagious infectious disease characterized by inflammation in upper respiratory tracts.It is a worldwide popular disease.The early and accurate diagnosis is essential to control this disease.The common diagnosis methods include pathogenic detection and serolog.Pathogenic detection has advantages of highly specific,and sensitive but time-consuming and cost-consuming,while serological diagnosis has advantages of sensitivity,low cost,convenience and rapidity.As the marker vaccines are increasingly used in eradication of IBR,differential diagnosis techniques are used to idifferentiate vaccine immunization and natural infection.In this paper,the progress on IBR diagnosis was summarized in order to provide reference for IBR diagnosis and control.

Infectious bovine rhinotracheitis;Bovine herpesvirus 1; diagnosis；vaccine

2016-09-29

现代农业(肉牛/牦牛)产业技术体系专项资金项目(CARS-38)；教育部高校博士点基金项目(20130146110003)

张 芳(1991-)，女，湖南益阳人，硕士研究生，主要从事兽医传染病学研究。*通讯作者

S852.659.1;S852.653

A

1007-5038(2017)04-0093-05