聚γ谷氨酸生物合成与DegR关系及其免疫佐剂效果研究

田光明，游 蕾

(1.长江大学动物科学学院，湖北荆州 434023；2.长江大学城市建设学院，湖北荆州 434023)



聚γ谷氨酸生物合成与DegR关系及其免疫佐剂效果研究

田光明1，游 蕾2*

(1.长江大学动物科学学院，湖北荆州 434023；2.长江大学城市建设学院，湖北荆州 434023)

为探讨调节因子DegR对聚γ谷氨酸(γ-PGA)生物合成产量的影响，比较聚γ谷氨酸佐剂和传统铝佐剂的辅助免疫效果，利用P43启动子构建了穿梭表达载体pHY-degR，通过电转化地衣芽胞杆菌WX-02获得重组菌株WX-02/pHYdegR。同时以福尔马林灭活的金黄色葡萄球菌蛋白疫苗作为免疫原，分别以不同分子质量聚γ谷氨酸佐剂和铝佐剂制备相关疫苗并免疫小鼠，7 d后注射金黄色葡萄球菌，根据小鼠死亡数，计算其相对免疫保护率。结果显示，过表达degR后，聚γ谷氨酸生物合成产量提高至28.5 g/L，相比对照菌株WX-02/pHY300提高22.6%。分子质量2×103ku聚γ谷氨酸作为佐剂的相对免疫保护率效果最好(78.9%)，优于铝佐剂免疫保护率(52.6%)和未添加佐剂免疫保护率(42.1%)。结果表明，过表达degR基因能提高聚γ谷氨酸生物合成量，且聚γ谷氨酸作为疫苗佐剂能增强疫苗免疫效果，可作为理想的疫苗佐剂。

地衣芽胞杆菌；聚γ谷氨酸；degR；疫苗佐剂；免疫效果

聚γ谷氨酸(poly-γ-glutamic acid，γ-PGA)是一类天然的阴离子型高分子聚合物，由L-谷氨酸和D-谷氨酸单体通过γ酰胺键聚合而成，其分子质量在1×101ku～1×104ku之间[1]。 由于γ-PGA具有良好的水溶性、可吸附性、可被生物降解，且无毒害等优良特性，在动物医学中应用研究越来越深入[2]。Tian M等[3]发现γ-PGA结合的造影剂成像效果相比其他造影剂具有更好的弛豫性和安全性。高分子质量γ-PGA可显著调节小鼠免疫系统NK细胞，饲喂小鼠高分子质量γ-PGA后，小鼠NK细胞被激活，抗肿瘤的效果显著优于其他诱导剂[4]。γ-PGA和L-苯丙氨酸复合物可以激活吞噬细胞和小细胞，减轻炎症反应症状，与常规类固醇类药物可以引起并发症相比，γ-PGA和L-苯丙氨酸复合物具有无毒副作用等明显的优势[5]。在细菌性和病毒性传染病研究中，Kim E H等[6]发现，γ-PGA可以促进感染流感病毒小鼠体内产生IFN-β和IL-12等细胞因子，且小鼠体内NK细胞和抗原CTL活性显著提高。在药物载体和疫苗佐剂研究中，Okamoto S等[7]在流感血球凝集素疫苗中添加γ-PGA，增强了小鼠体内保护性免疫能力。进一步研究发现，γ-PGA作为疫苗佐剂能显著提高脑炎小鼠血清抗体效价，且单剂量注射小鼠存活率为100%[8]。Hee S M等[9]在家兔中利用γ-PGA作为胃肠炎病毒疫苗佐剂，发现其抗体数量明显高于未添加γ-PGA佐剂疫苗。众多研究成果表明，γ-PGA在动物医学中有着良好的应用前景。

γ-PGA主要由微生物发酵产生，生物合成量是限制γ-PGA在动物医学领域的制约因素之一。目前关于提高γ-PGA产量的研究主要集中在以下几个方面:利用基因工程技术进行代谢途径改造[10]，改变γ-PGA中D/L型谷氨酸的比例[11]，改变γ-PGA的分子质量[12]，提高细胞对氧的摄取能力[13]。优化培养基，包括添加金属离子Mn2+和Ca2+，一些前体物质包括α-酮戊二酸、柠檬酸、谷氨酰胺等[14]。优化发酵条件、改变通气量、pH和搅拌转速[15]等系列措施提高γ-PGA产量。但通过对γ-PGA合成调控途径的改造来提高γ-PGA产量的报道较少。

DegU是一个多态性调节因子，通过促进或抑制受其调节的靶基因的转录[16]。不同磷酸化程度的DegU调控着不同的细胞活动。本试验通过表达DegU磷酸化正调节因子degR的表达水平，研究其对地衣芽胞杆菌合成γ-PGA的影响，同时研究不同分子质量γ-PGA作为疫苗佐剂对小鼠相对免疫保护率的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 大肠埃希菌DH5α(F-Φ80d/lacZΔM15,Δ(lacZYA-argF)U169,recA1,endA1,hsdR17 (rK-,mK+),phoA,supE44,λ-, thi-1,gyrA96,relA1);地衣芽胞杆菌WX-02(CCTCC M208065,野生菌)、地衣芽胞杆菌WX-02/pHYdegR(WX-02含pHYdegR质粒的过表达菌株)、地衣芽胞杆菌WX-02/pHY300(WX-02含pHY300PLK空质粒菌株)；地衣芽胞杆菌WX-02与金黄色葡萄球菌由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室惠赠。质粒pHY300PLK，E.coli-B.licheniformis穿梭质粒,Apr(E.coli),Tetr(E.coliandB.licheniformis)；pHY-degR，pHY300PLK含有B.subtilisP43启动子、B.licheniformisWX-02 degR基因和amyL基因；Staphylococcusaureus为野生菌，表达质粒pHY300PLK用于degR过表达。

1.1.2 实验动物 昆明小鼠,40日龄，平均体重20 g±2 g，无病无伤，定期投喂饲料。

1.1.3 主要试剂及培养基 γ-PGA，长江大学湿地生态与利用教育部工程研究中心制备保存；蛋白定量试剂盒、DNA提取试剂盒、限制性内切酶、T4连接酶等，天根生化科技有限公司产品。

大肠埃希菌和地衣芽胞杆菌于LB培养基中培养。地衣芽胞杆菌发酵γ-PGA的培养基参考Tian G等[12]配方。四环素浓度为20 μg/mL。

大豆肉汤培养基成份为胰蛋白胨 17 g/L，大豆蛋白胨3 g/L，葡萄糖 2.5 g/L，氯化钠 10 g/L，K2HPO42.5 g/L。

1.2 方法

1.2.1 表达载体pHY-degR构建 根据地衣芽胞杆菌WX-02的degR基因序列设计引物degR-F，degR-R(表1)扩增degR基因基因大小为183 bp；以amyL-F，amyL-R为引物，扩增淀粉酶终止序列片段(501 bp)；以枯草芽胞杆菌168的总DNA为模板，以P43-F和P43-R为引物，扩增P43启动子序列片段(388 bp)。 以上述3个片段为模板，以P43-F和amyL-R为引物，通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)， 得到融合片段P43-degR-amyL。PCR产物纯化后与pHY300PLK载体同时用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ进行酶切，回收后进一步用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞。挑取单菌落进行菌落PCR验证，提取阳性菌落质粒进行PCR和酶切验证并测序，构建成功的重组表达质粒命名为pHY-degR。

表1 引物

注：下划线为限制性内切酶酶切位点。

Note：Underline means restriction enzyme cleavage site.

1.2.2 degR强化表达菌株构建 将上述得到的重组质粒和空质粒pHY300PLK电转化地衣芽胞杆菌WX-02菌株。经抗性筛选和菌落PCR验证，得到阳性转化子，提取重组菌中的pHY-degR质粒，以质粒作为模板，引物pHY300-YF/pHY300-YR进一步进行PCR验证。过表达degR的菌株和转化空质粒菌株分别命名为WX-02/pHYdegR和WX-02/pHY300。

1.2.3 摇瓶发酵

1.2.3.1 菌种活化 从超低温冰箱中取出保藏的菌种划线LB平板培养基中，37℃培养基12 h。

1.2.3.2 种子培养 以LB为种子培养基，250 mL三角瓶装液量50 mL，37℃、180 r/min培养9 h。

1.2.3.3 γ-PGA发酵条件 接种量3%，250 mL三角瓶装50 mL发酵培养基，37℃、180 r/min培养36 h。

1.2.4 免疫原制备 无菌条件下，接种金黄色葡萄球菌至LB培养基，摇床振荡培养16 h后收集菌体，加入终浓度为3.0 mL/L福尔马林，恒温灭活后提取蛋白，测定蛋白浓度，调整至0.2 mg/mL。

铝胶盐佐剂疫苗制备[17]：免疫原与实验室制备的铝胶盐佐剂按5∶1(V/V)充分混匀，置4℃冰箱备用。

γ-PGA佐剂疫苗制备：取γ-PGA溶解于灭菌ddH2O，浓度为1 000 mg/mL，取免疫原与此浓度γ-PGA按体积比5∶1(V/V)混匀，置4℃冰箱备用。

1.2.5 动物免疫 取小鼠40只随机分成6组，免疫Ⅰ组小鼠分别背部皮下注射铝胶盐佐剂疫苗, 免疫Ⅱ组、免疫Ⅲ组、免疫Ⅳ组分别注射分子质量为2×102、2×103、6×103ku γ-PGA佐剂疫苗，免疫Ⅴ组注射不添加佐剂疫苗，对照组注射等量灭菌生理盐水。

1.2.6 免疫保护试验 免疫后7 d，6组小鼠分别腹腔注射0.5 mL金黄色葡萄球菌菌液，菌数为1×108CFU，观察7 d，记录小鼠死亡情况，计算相对免疫保护率。

1.2.7 分析方法

1.2.7.1 生物量和残留葡萄糖含量测定 菌体生物量测定采用光密度法。取一定体积的发酵液稀释适当倍数，调酸至pH2.5，离心去上清，用蒸馏水洗涤2次，稀释合适范围，分光光度计测定600 nm的吸光度值。发酵液中残留葡萄糖利用生物传感分析仪SBA-40E进行测定。

1.2.7.2 高效液相色谱法(HPLC)测定乙酸与聚γ谷氨酸浓度 发酵液预处理：利用去离子水将发酵液稀释30倍，离心除菌体，经0.22 μm水相滤膜过滤后进行HPLC-凝胶渗透色谱检测。凝胶渗透色谱检测条件为：采用TSK Gel G6000 PWXL凝胶渗透色谱柱，检测波长220 nm，进样量10 μL，流动相为25 mmol/L的无水硫酸钠和乙腈的混合液，体积比8∶1，流速0.5 mL/min。

1.2.7.3 气相色谱法检测乙偶姻与 2, 3-丁二醇浓度 取1 mL发酵液，12 000 r/min，离心4 min，取上清经乙酸乙酯萃取，以正丁醇为内标，萃取后的2,3-丁二醇的含量由气相色谱仪完成。气相色谱参数如下：伽诺FFAP毛细管柱 (30 m×0.32 mm ID, 0.33 μm Film)，火焰离子化检测器，载气为N2，流量为1.0 mL/min，氢气流量30 mL/min，空气流量300 mL/min，不分流进样，进样量1 μL，进样器温度200℃，检测器温度280℃，柱温箱升温程序：40℃保持1 min，以6℃/min升温至60℃保持1.5 min，以15℃/min升温至160℃保持2.5 min。采用内标法计算乙偶姻和2, 3-丁二醇的含量。

1.2.7.4 相对免疫保护率 相对免疫保护率依据下列公式进行计算：

相对免疫保护率=(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100%。

1.2.8 数据处理 每组试验设计3个重复，计算出数据的平均值和标准偏差；采用Origin 8.5进行数据处理分析；并采用SPSS18.0进行统计分析，在One way ANOVA下进行t检验分析，比较两两样品之间的差别，(P<0.05)为差异显著。

2 结果

2.1 表达载体pHY-degR的构建

将阳性转化子质粒包含的1 062 bp融合片段P43-degR-TamyL进行双酶切验证，酶切电泳结果如图1所示，片段大小与预期相符，将构建好的表达质粒测序，结果显示，插入片段区域未发生突变，表明degR表达质粒构建成功，命名为pHY-degR。

M.DNA 标准DL 5 000;1、2.重组质粒pHY-degR经EcoRⅠ 和 Xba Ⅰ双酶切产物

2.2 重组地衣芽胞杆菌菌株构建

提取阳性转化子粒DNA为模板，进行PCR鉴定，如图2所示，PCR结果大小与预期相符，成功获得了degR强化表达菌株和转化空质粒菌株，分别命名为WX-02/pHYdegR和WX-02/pHY300。

2.3 溢代谢产物乙偶姻，2, 3-丁二醇和乙酸检测

发酵终点重组菌株和对照菌株主要溢流代谢物乙偶姻，2, 3-丁二醇和乙酸的含量如表2所示，过表达degR后，重组菌中溢流代谢物乙偶姻，2, 3-丁二醇和乙酸含量分别为8.3、11.55、3.35 g/L。分别比对照菌株降低了20.9%、10%和20%。

M.DNA 标准DL 5 000;1.degR过表达质粒;2.空质粒

表2 degR强化表达对乙偶姻和2,3-丁二醇，乙酸浓度的影响

2.4 发酵过程生物量及γ-PGA产量检测

对重组菌株WX-02/pHYdegR和对照菌株WX-02/pHY300进行摇瓶发酵，检测发酵过程中残留葡萄糖、生物量以及γ-PGA产量。结果如图3所示，在发酵前20 h，重组菌株WX-02/pHYdegR生物量与对照菌株相当，20 h之后到发酵终点，重组菌株生物量略低于对照菌株；重组菌株葡萄糖消耗与生物量的趋势一致。重组菌株WX-02/pHYdegR发酵前20 h，γ-PGA产量与对照菌株差别不大，发酵后期，其γ-PGA产量比对照菌株要高，发酵结束后，γ-PGA产量显著高于对照菌株。过表达degR基因重组菌株γ-PGA的产量达到28.5 g/L，相比对照菌株WX-02/pHY300提高了22.6%。

2.5 相对免疫保护率

攻毒7 d后，免疫Ⅰ、Ⅱ组和免疫对照组均表现出明显的相对保护率，免疫I组相对保护率为52.6%，免疫Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组相对保护率分别为68.4%、78.9%和63.1%，免疫Ⅴ组相对保护率为42.1%(表3)。对攻毒感染试验死亡小鼠进行剖检，分离培养细菌进行鉴定，确定试验死亡原因为感染金黄色葡萄球菌致死。

图3 重组菌株WX-02/pHYdegR和对照菌株WX-02/pHY300发酵过程曲线

表3 活菌攻毒后小鼠死亡率和相对免疫保护率

3 讨论

疫苗佐剂是动物疫苗中重要的组成部分，可作为辅助物质增强疫苗免疫作用，增强机体对抗原的特异性应答，被广泛应用于疫苗制备。合适的疫苗佐剂对于提高疫苗效果有着重要的意义[18-19]。

γ-PGA是一类由微生物产生的天然高分子聚合物，具有无毒、可降解等特性，逐渐为人们认可并重视，应用前景广阔。随着对γ-PGA的研究的深入，其生物合成产量成为限制其在疫苗佐剂中应用的重要障碍。地衣芽胞杆菌是重要的γ-PGA生产菌株，研究表明，DegR能够促进DegU磷酸化，从而提高磷酸化的DegU浓度，进而激发受高浓度磷酸化DegU调控的基因的表达[20]。 高磷酸化程度DegU亦可激活聚γ-PGA合成酶的编码基因转录，从而提高γ-PGA产量[21]。本试验结果显示，在γ-PGA生产菌株地衣芽胞杆菌中加强degR基因转录水平可降低乙偶姻、2, 3-丁二醇和乙酸等溢流代谢产物产量，最终导致γ-PGA产量显著提高，该结果与Ohsawa T等[21]与Stanley N R等[22]的研究结果一致。动物免疫保护结果表明，相比传统铝佐剂，γ-PGA作为疫苗佐剂具有进一步增强小鼠机体抵抗金黄色葡萄球菌感染的能力，可产生较强的免疫应答，其中以分子质量为2×103ku γ-PGA佐剂相对免疫效果最佳。该结果与Kim E H等[6]和Okamoto S等[7]研究发现的γ-PGA可增强小鼠体内免疫能力结果一致。本研究以DegU磷酸化正调节因子degR基因为研究对象，发现过表达degR基因可以降低溢流代谢产物生成，最终提高γ-PGA生物合成量。同传统铝佐剂相比，γ-PGA能刺激机体产生更好的免疫效果，本试验进一步证实γ-PGA能增强小鼠机体免疫力，为γ-PGA在细菌疫苗佐剂在疫苗研制中的应用提供了理论基础。

综上所述，本研究提供了一种有效的增强γ-PGA生物合成的方法，该方法在γ-PGA生产中具有重要的应用价值，同时为扩大具有生物降解等优良特性的γ-PGA在动物疫苗中应用提供了宝贵依据。

[1] Ogunleye A,Bhat A,Irorere V U,et al.Poly-γ-glutamic acid:production,properties and applications[J].Microbiology,2015,161(1):1-17.

[2] Shih I L,Van Y T.The production of poly-(gamma-glutamic acid) from microorganisms and its various applications[J].Bioresource Technol,2001,79(3):207-225.

[3] Tian M,Wen X,Jackson E F,et al.Pharmacokinetics and magnetic resonance imaging of biodegradable macromolecular blood-pool contrast agent PG-Gd in non-human primates: a pilot study[J].Contrast Media & Molecular Imaging,2011,6(4):289-297.

[4] Kim T W,Lee T Y,Bae H C,et al.Oral administration of high molecular mass poly-γ-glutamate induces NK cell-mediated antitumor immunity[J].J Immunol,2007,179(2):775-780.

[5] Ryu M,Nakazawa T,Akagi T,et al.Suppression of phagocytic cells in retinal disorders using amphiphilic poly(γ-glutamic acid) nanoparticles containing dexamethasone[J].J Controlled Release,2011,151(1):65-73.

[6] Kim E H,Choi Y K,Kim C J,et al.Intranasal administration of poly-gamma glutamate induced antiviral activity and protective immune responses against H1N1 influenza A virus infection[J].Virol J,2015,12(1):1-10.

[7] Okamoto S,Yoshii H,Ishikawa T,et al.Single dose of inactivated Japanese encephalitis vaccine with poly(γ-glutamic acid) nanoparticles provides effective protection from Japanese encephalitis virus[J].Vaccine,2008, 26(5):589-594.

[8] Okamoto S,Matsuura M,Takami A,et al.Poly(γ-glutamic acid) nano-particles combined with mucosal influenza virus hemagglutinin vaccine protects against influenza virus infection in mice[J].Vaccine,2009,27(42):5896-5905.

[9] Hee S M,Joong K C,Ryoung P H,et al.Composition for adjuvant containing poly-gamma-glutamic acid: WO090968[P].2006.

[10] Feng J,Gu Y,Quan Y,et al.Improved poly-γ-glutamic acid production inBacillusamyloliquefaciensby modular pathway engineering[J].Metabolic Engineer,2015,32:106-115.

[11] Jiang F,Qi G,Ji Z,et al.Expression of glr gene encoding glutamate racemase inBacilluslicheniformisWX-02 and its regulatory effects on synthesis of poly-γ-glutamic acid[J].Biotechnol Let,2011,33(9):1837-1840.

[12] Tian G,Fu J,Wei X,et al.Enhanced expression of pgdS gene for high production of poly-γ-glutamic aicd with lower molecular weight in Bacillus licheniformis WX-02[J].J Chem Technol Biotechnol,2014,89(12):1825-1832.

[13] Zhang W,Xie H,He Y,et al.Chromosome integration of the Vitreoscilla hemoglobin gene (vgb) mediated by temperature-sensitive plasmid enhances γ-PGA production inBacillusamyloliquefaciens[J].FEMS Microbiol Let,2013,343(2):127-134.

[14] Li X,Gou X,Long D,et al.Physiological and metabolic analysis of nitrate reduction on poly-γ-glutamic acid synthesis inBacilluslicheniformisWX-02[J].Arch Microbiol,2014,196(11):791-799.

[15] Bajaj I B,Singhal R S.Effect of aeration and agitation on synthesis of poly (γ-glutamic acid) in batch cultures ofBacilluslicheniformisNCIM 2324[J].Biotechnol Bioproc Enginee,2010,15(4):635-640.

[16] Kobayashi K.Gradual activation of the response regulator DegU controls serial expression of genes for flagellum formation and biofilm formation inBacillussubtilis[J].Mol Microbiol,2007,66(2):395-409.

[17] 侯伟杰,高 洋,高晶晖,等.三种佐剂对奶山羊乳房炎灭活疫苗免疫效果的影响[J].动物医学进展,2015,36(1):45-48.

[18] 刘宇卓,李嘉萍,李 银,等.不同佐剂制备的鸡坦布苏病毒灭活疫苗免疫效果比较[J].江西农业学报,2016,28(10):60-63.

[19] 王 凯,何天骏,胡福良.蜂胶佐剂在兽用疫苗中的应用[J].动物医学进展,2013,34(10):111-115.

[20] Mukai K,Kawata-Mukai M,Tanaka T.Stabilization of phosphorylatedBacillussubtilisDegU by DegR[J].J Bacteriol,1992,174(24):7954-7962.

[21] Ohsawa T,Tsukahara K,Ogura M.Bacillussubtilisresponse regulator DegU is a direct activator of pgsB transcription involved in γ-poly-glutamic acid synthesis[J].Biosci Biotechnol Biochem,2009,73(9):2096-3102.

[22] Stanley N R,Lazazzera B A.Defining the genetic differences between wild and domestic strains ofBacillussubtilisthat affect poly-γ-DL-glutamic acid production and biofilm formation[J].Mol Microbiol, 2005,57(4):1143-1158.

Study on Poly-γ-glutamic Acid Biosynthesis with degR Overexpression and Poly-γ-glutamic Acid Adjuvant Effect

TIAN Guang-ming1,YOU Lei2

(1.CollegeofAnimalScience，YangtzeUniversity,Jingzhou,Hubei,434023,China; 2.SchoolofUrbanConstruction,YangtzeUniversity,Jingzhou,Hubei,434023,China)

To investigate the effect of the overexpression of degR gene on the yield of poly-γ-glutamic acid and the immune effect of γ-PGA adjuvant,an engineered strain ofB.licheniformis(WX-02/pHYdegR) was developed.Transformation ofB.licheniformisWX-02 with a shuttle plasmid pHY-degR builded by strong promoter P43 was performed via electroporation.Meanwhile,formalin-killedStaphylococcusaureusproteins were used as immunogen with different adjuvants (alum adjuvant and γ-PGA adjuvant) to immunize healthy mice.The relative immune protection rate was measured after 7 days according to the mouse mortality after injecting viableStaphylococcusaureus.The results showed that the yield of γ-PGA reached 28.5 g/L,increased by 22.6% in comparison with that of the control (23.25 g/L) by enhancing expression of degR geneinvivo.In the immune-protective experiment,the immunogen mixed with γ-PGA adjuvant (2×103ku) had the best immune effect (78.9%) compared with alum adjuvant (52.6%) and pure immunogen (42.1%).Therefore,γ-PGA adjuvant can be used as an ideal adjuvant in veterinary field.

Bacilluslicheniformis;poly-γ-glutamic acid; degR;adjuvant;immune effect

2016-11-11

湖北省教育厅青年人才基金项目(q20151306);湿地生态与农业利用教育部工程研究中心基金项目(KF201509)

田光明(1979-)，男，江苏盐城人，博士研究生，主要从事动物医学微生物研究。*通讯作者

S852.4

A

1007-5038(2017)04-0046-06