鹅蛔虫ITS rDNA的分子特征及种类分析

李 欣，田守龙，何柳芬，刘百强，贾 佳，任邵娜，蒲文珺，张浩吉

(佛山科学技术学院动物医学系，广东佛山 528231)



鹅蛔虫ITS rDNA的分子特征及种类分析

李 欣，田守龙，何柳芬，刘百强，贾 佳，任邵娜，蒲文珺，张浩吉*

(佛山科学技术学院动物医学系，广东佛山 528231)

为探究从广东省清远的鹅体内采集的蛔虫(Ascaridiaanseris)的种类，对临床采集的鹅蛔虫样品，在形态观察的基础上，用保守引物NC5和NC2扩增鹅蛔虫的ITS rDNA基因片段，将扩增产物经克隆测序后，获得大小为1 009 bp的鹅蛔虫ITS rDNA基因序列(GenBank登录号为KC905082)。序列比对和系统进化分析表明，鹅蛔虫5.8 S rRNA基因与GenBank 收录的鸡蛔虫(登录号为AJ001508)同源性为96%，而与不同地理株的鸽蛔虫的同源性在91%～96%之间；禽蛔科的鸡蛔虫、鸽蛔虫和鹅蛔虫同一进化分支，鹅蛔虫、鸡蛔虫和鸽蛔虫处于各自的独立进化分支。上述证明，鹅蛔虫是不同于鸽蛔虫的一个独立有效种，在系统发生关系上与鸡蛔虫更亲近。

鹅蛔虫；内转录间隔区核糖体DNA；聚合酶链反应；序列分析

鹅蛔虫(Ascaridiaanseris)隶属于禽蛔科(Ascarididae)禽蛔属的一种大型线虫，虫体寄生于鹅的小肠，主要分布于我国和前苏联的一些地区[1]。鹅感染后主要症状为食欲不振、精神沉郁、羽毛松乱、下痢、消瘦，对养鹅业带来一定的危害。虫体种类鉴定是寄生虫病诊断和防控的基础，传统的寄生虫鉴定方法主要是依据虫体形态学特征进行鉴定，此法简单通用，但是对形态相近的虫体、虫卵以及幼虫，形态学鉴定具有一定局限性[2-3]。隶属于禽蛔科的鸡蛔虫(A.galli)、鸽蛔虫(A.columbae)和鹅蛔虫(A.anseris)各自寄生的宿主不同，但虫体形态差异很小，尤其是鹅蛔虫，在临床上鲜有感染和发病的报道，而且对鹅蛔虫种类的有效性也存在争议[4]。

随着现代分子生物学技术的不断发展，将PCR扩增和序列分析技术相结合，可以在基因水平揭示物种间的差异和系统发生关系[5]。其中ITS rDNA是最常选用的遗传标记[6]。ITS是核糖体DNA中介于18 S和28 S之间的内转录间隔区，包括 ITS1、5.8S和ITS2三段序列[7]。由于其两端为小亚基和大亚基，不会像rRNA基因那样受到功能上的限制。 ITS区域倾向于比较高的进化速率，在核苷酸序列和长度上导致了很大的变异性[8]。ITS rDNA在物种进化过程中显示种的特征，在种内具有高度保守性，在不同种间又有不同程度的变异，是最广泛应用于寄生虫种间分类鉴定的理想遗传标记[9-10]。本试验对采集自广东鹅小肠的鹅蛔虫在形态学观察的基础上进行基因组DNA抽提，用能扩增虫体ITS区的通用引物进行PCR扩增和序列分析，以期为鹅蛔虫的分子鉴定提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 试验所用的虫体均为2012年9月从广东省清远鹅场的临床病鹅的小肠里收集的鹅蛔虫，样本标注为A.anseris-1和A.anseris-2，经生理盐水清洗干净后保存于750 mL/L的酒精溶液中备用。

1.1.2 主要试剂 LB Broth，上海生工生物工程技术服务有限公司产品；Amp、IPTG、X-Gal、Agar、EcoRⅠ、HindⅢ、DNA Marker DL 2 000、DL 5 000、ExTaqDNA聚合酶、pMD-18T载体、DH5ɑ感受态细胞、MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0，宝生物工程(大连)有限公司产品。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 虫体DNA抽提 从保存于750 mL/L酒精中取出单个的成虫，用双蒸水反复吹打冲洗3次，称重10 mg，将虫体组织置于1.5 mL EP管中，用灭菌且经紫外灯照射过的微型剪刀将虫体组织剪碎，根据DNA提取试剂盒推荐的步骤提取虫体DNA，作为PCR反应的模板，置-20℃冰箱保存。

1.2.2 虫体ITS rDNA的PCR扩增 参照文献报道[11-12]的扩增寄生虫ITS rDNA的引物，引物序列为NC5：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′；NC2：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，使用时加入灭菌双蒸水稀释成10 μmol/mL，分装后置-20℃保存备用。

PCR反应体系为50 μL， 其中ExTaqDNA聚合酶25 μL，引物NC5和NC2各2 μL(10 μmol/mL)，虫体DNA模板 4 μL，加入灭菌双蒸水至50 μL。以实验室保存的鸽蛔虫基因组DNA为模板作为阳性对照，以蒸馏水为模板作为阴性对照。轻微振荡并离心之后进行PCR反应。PCR扩增条件为：94℃ 5 min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 10 min，于12℃终止。

取6 μL 的PCR扩增产物，用10 g/L的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳仪设置电压150 V，100 mA，紫外透射仪观察结果，并拍照记录。

1.2.3 PCR产物的克隆鉴定和序列测定 将胶回收纯化的基因片段连接至pMD-18T载体，转化至DH5ɑ感受态细胞，涂布LB/Amp/X-gal/IPTG平板培养基37℃培养12 h～24 h，从每个平板上随机挑选单个白色菌落，再使用 LB/Amp+培养基振荡培养12 h～16 h。按照质粒提取试剂盒说明书将菌体中的质粒提取，再将质粒进行PCR检测，选出阳性质粒，取10 μL质粒，用EcoRⅠ和HindⅢ，37℃ 4 h，双酶切检验重组质粒，挑选出阳性重组质粒送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。

1.2.4 序列比对和系统进化分析 对测序获得序列进行拼接，除去头尾载体通用引物部分序列，截取完整NC引物扩增序列全长，将检测的序列提交至NCBI进行Blast比较和分析。用Clustal X 2.1[13]对获得的序列分别进行比对分析，用DNA Star 7.0软件将测序结果与GenBank收录的对不同种类的蛔虫的内转录间隔区基因序列进行核苷酸同源性比对，构建种系关系进化树，确定鹅蛔虫的种类分子特征和系统发生关系。

登录NCBI网站，从GenBank下载蛔目的代表性种类的ITS rDNA序列。包括蛔科(Ascaridae)蛔属(Ascaris)的人蛔虫(A.lumbricoides)和猪蛔虫(A.suum)，禽蛔科(Ascarididae)禽蛔属(Ascaridia)的鸡蛔虫(A.galli)和鸽蛔虫(A.columbae)，弓首科(Toxocaridae)弓首属(Toxocara)的犬弓首蛔虫(T.canis)、猫弓首蛔虫(T.cati)以及弓蛔属的狮弓蛔虫(Toxascarisleonina)，进行进行同源性分析以及种系进化树的绘制(表1)。

2 结果

2.1 虫体ITS rDNA的扩增结果

用保守引物NC5/NC2对虫体的ITS rDNA进行PCR扩增，结果采自清远某鹅场的2个样品和以鸽蛔虫作为阳性对照，均扩增出大小约1 100 bp的目的条带(图1)，与预期片段大小相符，无非特异性条带出现。

M.DNA 标准DL 2 000;1.阴性对照；2.阳性对照；3.A.anseris-1；4.A. anseris-2

2.2 重组质粒的鉴定

将胶回收纯化的目的片段连接至pMD-18T载体，转化至DH5ɑ感受态细胞中。对构建的重组质粒按上述方法进行PCR扩增，得到和虫体DNA条带大小相同的片段。用限制酶EcoRⅠ单酶切，再用限制酶EcoRⅠ和HindⅢ对构建的重组质粒进行双酶切，双酶切结果得到3条大小750 bp～800 bp、250 bp～350 bp和2 000 bp～3 000 bp的条带，根据载体的酶切位点，限制酶EcoRⅠ和HindⅢ将目的片段切割成2个大小不同的片段(图2)。

M1.DNA标准 DL 2 000；M2.DNA标准 DL 5 000；1.A.anseris-1；2.A.anseris-2

2.3 DNA序列的比对分析

2.3.1 序列测定比对以及同源性分析 核苷酸同源性分析结果见表2。

表2 鹅蛔虫与蛔虫代表性样品的5.8 S rRNA基因的核苷酸同源性分析

对试验获得的鹅蛔虫2个样品的扩增结果，经测序后除去特异性引物和前后端载体的通用引物片段，均得到一段长度为1 009 bp的鹅蛔虫ITS rDNA序列，该序列C+G含量为39.06%，包括ITS1、ITS2的大部分序列以及全长5.8 S rRNA基因的序列，2个鹅蛔虫样品ITS rDNA的序列同源性为100%，该序列提交至GenBank收录登录号为KC905802。与禽蛔科的其他蛔虫一样，试验获得的鹅蛔虫5.8 S rRNA基因长度为157 bp的序列，ITS1长为475 bp，ITS2长为377 bp。在NCBI网站基于5.8 S rRNA基因的禽蛔科多种蛔虫的Blast分析显示，试验获得的鹅蛔虫5.8 S rRNA基因与GenBank收录的鸡蛔虫(登录号为AJ001508)和鸽蛔虫的(登录号为：JQ995321)5.8 S rRNA基因核苷酸序列的同源性均为96%，与鸽蛔虫(登录号为：AJ001509)的同源性为93%。与本实验室采集自佛山鸽蛔虫(登录号为：KF147909)[14]的同源性为91%。

使用DNA Star7.0软件，通过Clustal W方法，将试验获得序列与GenBank收录的蛔目不同科、属的蛔虫代表性样品的5.8 S rRNA基因的核苷酸同源性比较结果见表2。

2.3.2 ITS rDNA序列的系统进化分析 试验获得的鹅蛔虫ITS rDNA序列包括ITS1、ITS2的大部分序列以及全长5.8 S rRNA基因的序列，基于5.8 S rRNA基因和ITS1+5.8 S+ITS2绘制的蛔虫系统发育树分别见图3和图4。

图3 基于5.8 S rRNA基因的鹅蛔虫与其他相关蛔虫的系统进化树

图4 基于ITS1+5.8 S+ITS2序列的鹅蛔虫与其他相关蛔虫的系统进化树

3 讨论

据陈淑玉等主编的《禽类寄生虫学》记载，禽蛔科的鸡蛔虫(A.galli)可寄生于鸡、鹧鸪、针尾鸭和番鸭的肠道，其特征是尾乳突10对，交合刺长度为0.65 mm～1.95 mm；鸽蛔虫(A.columbae)可寄生于鸽、孔雀和山斑鸠，尾乳突为14对～15对，交合刺长度为1.76 mm～2.04 mm；前两种是非常普遍的禽蛔虫种类。而鹅蛔虫寄生于鹅的小肠，尾乳突为13对～14对，交合刺长度约为0.82 mm，仅报道于我国和前苏联[1]。而对鹅蛔虫种类的有效性，尚存在争议。国外有学者认为鹅蛔虫不是一个有效种，而是鸽蛔虫的同物异名[4]。因此，在我们将试验获得鹅蛔虫(A.anseris)ITS rDNA序列提交GenBank后，被认定为鸽蛔虫(A.columbae)，登录号为KC909582。一般认为，5.8 S rRNA基因具高度的保守性。试验从鹅蛔虫样品扩增获得的5.8 S rRNA基因与GenBank收录的鸡蛔虫(登录号为AJ001508)同源性为96%，而与不同地理株的鸽蛔虫5.8 S rRNA基因核苷酸序列的同源性在91%～96%之间，这表明鹅蛔虫是不同于鸽蛔虫的一个独立有效种，在系统发生关系上与鸡蛔虫更亲近。

林辉环[15]首次在我国广东报道了鹅蛔虫的感染，认为鹅蛔虫的形态跟鸡蛔虫相似，雄虫体长65 mm，雌虫体长91 mm，但其肛前吸盘周围没有辐射状的结构, 翼较小, 肛后乳突只有2对，这些特征可与鸡蛔虫区别之。目前，在除广东外，在贵州、浙江、湖南等地也有鹅感染蛔虫(Ascaridia)的报道，但由于缺乏种类的详细观察，往往都称之为禽蛔虫或鸡蛔虫(A.galli)[16-18]。本试验从广东清远鹅肠道采集的蛔虫的形态特征与林辉环所描述的相似，初步确定为鹅蛔虫。在形态学观察的基础上获得了具有分类鉴定意义的鹅蛔虫ITS rDNA序列，并藉此与蛔目的多个代表性蛔虫种进行系统进化分析。结果显示，不论是5.8 S rRNA基因和ITS1+5.8 S+ITS2都获得了相近的系统进化关系树形图，证明禽蛔科的3种蛔虫处于同一进化支，而鹅蛔虫形成了相对独立的进化分支。序列比对分析也发现，鹅蛔虫、鸡蛔虫和鸽蛔虫的ITS1序列相对保守，不同种类间的差异性小，种间同源性高达98%～100%。试验获得的鹅蛔虫ITS rDNA序列资料反映了虫种分子遗传特征，为鹅蛔虫的分子鉴定提供了依据。

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Species Analysis and ITS rDNA Molecular Characteristics ofAscaridiaanseris

LI Xin，TIAN Shou-long，HE Liu-fen，LIU Bai-qiang，JIA Jia，REN Shao-na，PU Wen-jun，ZHANG Hao-ji

(DepartmentofVeterinaryMedicine，FoshanUniversity，Foshan，Guangdong,528231，China)

In order to explore the species of theAscaridiaanseriscollected from the geese of Qingyuan,Guangdong provience,the conserved primers NC5 and NC2 were used to amplify the ITS rDNA of specimen ofAscaridiaanseriscollected from intestine of infected geese,and the recombinant plasmids were identified by polymerase chain reaction(PCR) and the products were sequenced.A 1 009 bp sequence in length of ITS rDNA ofA.anseris(KC905082) was obtained.Sequence Blast and phylogenetic analysis showed that the 5.8 S rDNA sequence ofA.anseriswas 96% identical with the same gene ofAscaridiagalli(AJ001508),and similarity was between 91% and 96% compared with specimens ofAscaridiacolumbaefrom different areas available in GenBank.TheA.anseris,A.galliandA.columbaerespectively grouped into each solitary clade.The results showed that theA.anserisis a independent valid species,which appeared to be closely related toA.gallion the phylogenetic relationship.

Ascaridiaanseris；ITS rDNA； PCR；sequence analysis

2016-08-25

广东省教育厅科技创新项目 (2013KJCX0187)

李 欣(1992-)，女，福建三明人，硕士研究生，主要从事动物疾病防控研究。

S852.731;S858.33

A

1007-5038(2017)04-0019-05

*通讯作者