禁食、急性冷暴露和外源性注射Ghrelin对羔羊生理指标的影响

王 琴，赵红琼*，许 琴，侯 宇，卡力比夏提·艾木拉江，闫书平，姚 刚，刘江伟，张 丹，王丽芳

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.新疆军区总医院实验动物科，新疆乌鲁木齐 830000)



禁食、急性冷暴露和外源性注射Ghrelin对羔羊生理指标的影响

王 琴1△，赵红琼1△*，许 琴2，侯 宇1，卡力比夏提·艾木拉江1，闫书平1，姚 刚1，刘江伟2，张 丹1，王丽芳1

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.新疆军区总医院实验动物科，新疆乌鲁木齐 830000)

为了探究禁食、急性冷暴露和注射外源性生长激素释放肽Ghrelin对羔羊生理指标的影响，本研究监测了室温禁食24 h后继续禁食并冷冻(-24.7 ℃ ± 0.2 ℃)2 h羔羊基本生命体征、血液生理指标和血糖浓度的变化，同时探究了外源性Ghrelin对于冷冻的禁食羔羊以上指标的影响。结果显示，在禁食后8、16、24 h羔羊呼吸频率、心率和血糖浓度均较禁食前显著降低(P<0.05)，在禁食后16 h和24 h直肠温度均较禁食前极显著降低(P<0.01)，而血液生理指标变化不明显(P>0.05)；在冷冻1.5 h和2.0 h后羔羊呼吸频率较保温组显著减慢(P<0.05)，心率和血糖浓度在冷冻后1.0、1.5、2.0 h显著增加(P<0.05)，冷冻过程中羔羊直肠温度差异不显著(P>0.05)；冷冻2 h后颈静脉一次性注射Ghrelin未发现对羔羊以上指标的影响(P>0.05)。以上研究结果提示，羔羊在禁食和低温情况下可通过调整自身活动，以维持机体稳态，并且Ghrelin可能并未参与该调整过程。

禁食；冷暴露；生长激素释放肽；羔羊；血糖

养羊业在我国西北畜牧业中占有重要地位，一般分为农区集中舍饲模式和牧区散养放牧模式。对于放牧的羊遇到暴风雪天气，由于气温低，大雪覆盖牧草，而储备干草不足的时候，这些羊会出现饥饿和冻伤情况，尤其是断奶羔羊由于抵抗力下降容易出现死亡情况。刘璐等[1-2]研究表明，经过24 h禁食羔羊再持续禁食并在-6.1 ℃～-14.7 ℃圈舍外冷暴露4 h～24 h可引起心率和呼吸加快，体温降低，甚至少部分羔羊死亡。但由于刘璐等冷暴露试验是在圈舍外进行，存在气温、湿度和风速等环境因素不稳定的问题。另外，生长激素释放肽(Ghrelin)除了具有公认的促进生长激素释放的作用，而且有研究表明Ghrelin可能参与饥饿和冷暴露时大鼠和鱼类机体稳态的调节[3-5]。因而本研究计划在气温条件稳定的人工冷冻舱探究急性冷暴露对禁食羔羊基本生命体征、血液生理指标和血糖的影响，同时也探究在冷暴露情况下外源性给予Ghrellin是否对以上指标具有干预作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 选取8只60日龄断奶后约1周的新疆细毛羊，公羔，试验初始体重 18.2 kg ± 0.8 kg，来源于新疆科创畜牧繁育中心。试验前1周羔羊集中在普通圈舍(20 ℃～30 ℃)进行适应性饲喂，每天饲喂2 次(11:00 和21:00)精料，每餐150 g/只，饲料购自新疆泰昆集团昌吉饲料有限责任公司，苜蓿干草和水自由采食。

1.1.2 试剂 羊酰基化Ghrelin(GSSFLSPEHQKLQRKEPKKPSGRLKPR，Uniprot序号：Q6BEG7)用多肽固相合成法合成，其生物学活性通过牛颈静脉注射1 μg/kg该Ghrelin促进生长激素分泌得到验证；肝素钠注射液，江苏万邦生化股份有限公司产品；乙二胺四乙酸二钠，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品；血糖测定试剂盒，北京利德曼生化股份有限公司产品。

1.1.3 仪器和设备 冷冻舱为西北地区特殊环境人工实验舱，由新疆军区总医院提供；全自动动物血液细胞分析仪，南京普朗医疗设备有限公司产品；温湿度仪，天津市津南区工艺美术陶瓷厂产品；SynergyHTX多功能酶标仪，美国Bio Tek仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试验分组 试验开始日，8只羔羊进行正常饲喂(如上适应性饲喂)，在第2天3:00开始禁食，但水自由饮用，在第3天11:00将4只羔羊放入保温圈(25.8 ℃±0.2 ℃)，为保温组，另外4只羔羊放入冷冻舱(气温-24.7℃±0.2℃)，为冷冻组。以上两组羔羊在13:00(即保温或冷冻2 h)每组选取2只(Ghrelin组)通过静脉留置针(用10 IU/mL肝素生理盐水抗凝维持)注射10 μg/kg Ghrelin，而另外2只(对照组)注射1 g/L牛血清白蛋白(BSA)，每只羔羊注射量为5 mL，因而羔羊共分为4组，即保温对照组、保温Ghrelin组、冷冻对照组和冷冻Ghrelin组。每只羔羊均按照不完全拉丁方试验设计，接受每种处理，试验共进行4次，每次试验之间动物休息2 d。

1.2.2 检测指标

1.2.2.1 圈舍或舱内气温和湿度的监测 在饲喂和禁食日(11:00、19:00、3:00)、冷冻时段(11:00、11:30、12:00、12:30、13:00)和注射时段(13:30和14:00)时间点之前测定气温和湿度，以监测动物所处圈舍内环境变化。圈舍内气温的监测用酒精温度计，湿度用温湿度仪记录，由于本试验羔羊头仰起身高约0.5 m，所以均将仪器高度放在离地面约0.5 m处。

1.2.2.2 羔羊基本生命体征的监测 在以上监测圈舍气温时间点慢慢靠近羔羊测定呼吸、心率和直肠温度。监测方法参考刘璐等报道[1]。

1.2.2.3 血液生理指标和血糖浓度的测定 在饲喂和禁食日(11:00、19:00、3:00)、冷冻时段(11:00、11:30、12:30、13:00)和注射时段(13:05、13:15、13:30和14:00)每只羊从静脉留置针采集5 mL血液，迅速注入含肝素钠 (8 IU/mL血液)的冰浴离心管，混匀，离心(4 ℃，3 000 r/min,20 min)，分离血浆，置-20 ℃冷冻贮藏，用于血糖的测定。同时，禁食日(11:00)、冷冻前(11:00)、注射时段前(13:00)、注射后(14:00)一部分采集血液注入含乙二胺四乙酸二钠 (50 mg/mL血液)的 1.5 mL离心管，用于血液生理指标(WBC、RBC、HGB和HCT)的检测；血液生理指标用全自动动物血液细胞分析仪测定。

1.2.3 数据处理 试验结果以均值 ± 标准误(Mean ± SEM)表示，用 SPSS 16. 0 软件进行双因素方差分析P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 禁食对羔羊基本生命体征、血糖和血液生理指标的影响

图1显示了在4轮羔羊饲喂和禁食试验过程中每天3个时间点(11:00、19:00和3:00)气温和湿度的变化，全天平均气温27.0 ℃ ± 1.0 ℃、平均湿度38.6 % ± 0.8%，在3个监测时间点中19:00气温较其他两个时间点高，而湿度相对最低。

由图2A和2B可见，在凌晨3:00开始禁食时羔羊呼吸频率和心率均较试验开始时(给料)11:00(呼吸频率为114次/min ± 4次/min，心率为118次/min ± 4次/min)显著减慢，并且在禁食后8、16、24 h均减慢(P<0.05或0.01)。由图2C可见，在禁食后16 h和24 h直肠温度均较给料时11:00 (40.0 ℃ ± 0.1 ℃)极显著降低(P<0.01)。由图2D可见，在禁食后8、16、24 h血糖浓度均较给料时11:00 (4.1 mg/dL ± 0.1 mg/dL)极显著降低(P<0.01)。全血白细胞总数、红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积在各采血点之间差异不显著(P>0.05)，试验前均值分别为7.8×109/L±0.4×109/L、10.2×1012/L±0.2×1012/L、106g/L±4 g/L和24%±1%。

图1 羔羊禁食过程中气温和湿度的变化

2.2 冷暴露对禁食羔羊基本生命体征和血糖的影响

羔羊禁食32 h后进入保温圈(气温25.8 ℃±0.2 ℃，湿度40.9%±0.2% )和冷冻舱(气温-24.7 ℃±0.2 ℃，湿度28.5%±0.9%)后呼吸频率、心率和血糖变化见图3。由图3A可见，在进入冷冻舱1.5 h和2.0 h时冷冻组羔羊呼吸频率较保温组显著减慢(P<0.05)；由图3B可见，心率在0.5 h较保温组显著加快(P<0.05)，在1.0、1.5 、2.0 h极显著加快(P<0.01)；而在整个试验过程中两组羔羊直肠温度差异不明显(P>0.05)，其均值为39.7 ℃±0.1 ℃；由图3C可见，冷冻组血糖浓度在1.0、1.5、2.0 h较保温组显著升高(P<0.05)。

2.3 外源性注射Ghrelin对羔羊基本生命体征和血糖的影响

羔羊在进入保温圈和冷冻舱后2 h注射外源性Ghrelin，从图4可见，尽管保温组和冷冻组之间(无论是否注射Ghrelin)呼吸频率、心率和血糖浓度均有差异(P<0.05或P<0.01)，但是在同一温度组同一时间点中Ghrelin注射组和对照组之间以上3种指标差异均不显著(P>0.05)，而且同一组羔羊在Ghrelin注射前后以上3种指标差异均不显著(P>0.05)。在整个试验过程中各组羔羊之间直肠温度差异不显著(P>0.05)。

A.呼吸频率;B.心率;C.直肠温度;D.血糖；同试验开始(11:00给料)值比较差异显著(P<0.05)用*表示，极显著(P<0.01)用**表示

A.呼吸频率；B.心率；C.血糖；保温组和冷冻组之间比较差异显著(P<0.05)用*表示，极显著(P<0.01)用**表示

A.呼吸频率；B.心率；C.血糖；同一时间点，两组之间比较差异显著(P<0.05)，用*表示，差异极显著( P<0.01)，用**表示

3 讨论

本试验结果显示，断奶羔羊在室温下禁食24 h，可引起呼吸频率和心率显著减慢，直肠温度显著下降，血糖浓度降低。张伯伟等[6]研究结果表明，新疆伊犁马在室温下禁食禁水48 h，期间时间点心率和呼吸频率均显著慢于正常饲喂马匹。Ohmura H等[7]报道，英纯血马禁食24 h内心率均低于正常采食马匹，这些结果同本试验结果一致。在禁食对血糖影响方面，在马、牛和鱼类研究显示,禁食一段时间后均观察到血糖浓度较正常饲喂动物降低的现象[8-11]。动物在禁食情况下，由于不能从外界获取能量，只有降低自身代谢水平，例如减弱心血管活动和呼吸运动，甚至降低体温，以维持基础代谢。另一方面，可能由于禁食使糖摄入和糖的异生原料减少，因而造成血糖浓度下降。

动物暴露于冷环境中，容易造成冷应激。新疆细毛羊属于毛肉兼用型，该品种适于干燥寒冷高原地区饲养，但羔羊在断奶应激和饥饿的情况下，对寒冷的抵抗力相对减弱。本试验结果表明，在禁食32 h后，新疆细毛羊羔羊在-24.7 ℃±0.2 ℃人工冷冻舱保持冷暴露2 h，同保温组比，在冷暴露0.5 h后心率加快，1.0 h 后血糖浓度升高，1.5 h后呼吸频率减慢，而体温在此过程中变化不明显。刘璐等[1]报道，禁食24 h的小尾寒羊在-13.3 ℃～-14.7 ℃急性冷暴露2 h，羔羊心率和呼吸频率均较保温组的羊快，血糖浓度在15 min后高于保温羊，体温变化也不明显。姜冬梅等[12]报道，禁食12 h的蛋鸡置于 3.0 ℃±1.0 ℃冷暴露5 h ，心率和呼吸频率分别在2 h和3 h后较试验前显著减慢。井霞[13]报道，冬季(12月～2月)慢性冷应激期荷斯坦奶牛的呼吸频率相对于秋季(9月～11月)非应激期显著下降。于长青等[14]发现， Wistar 大鼠置于4 ℃±2 ℃的冷环境，连续8周，每天冷暴露4 h，在第2周时心率较保温大鼠显著升高，并升高持续到第8周。蒋华琼等[15]报道，SD大鼠在急性冷暴露-15 ℃±1 ℃下3 h，引起直肠温度显著下降，血糖浓度也下降。大鼠在冷暴露情况下，出现体温下降情况[16]。从以上结果来看，冷暴露由于动物种属不同，暴露前动物生理状态不同以及冷暴露温度和持续时间不同，均可能影响动物基本生命体征或血糖浓度，但对各指标影响有所差异。在冷应激情况下，为了维持体温，增加贮存糖原的分解，而使血糖升高，为机体活动供能，因而对于体表保温能力相对较强的细毛羊，在急性冷应激情况下一般不会出现体温较大幅度的波动，而对于体表被毛相对较少的大鼠来说，其保温能力相对弱，这可能是冷应激情况下体温下降的原因。

之前初步研究[2]提示,外源性Ghrelin可影响羔羊冷应激引起的血糖升高，但是本试验结果显示，对于禁食羔羊，无论是在保温圈舍还是冷冻舱，静脉一次性注射外源性Ghrelin均未对羔羊基本生命体征和血糖浓度造成影响。Thidar Myint H等[17]给荷斯坦小母牛一次性静脉注射Ghrelin，在注射后2 h内未见血糖有显著变化。然而，在人类和鼠研究表明，外源性Ghrelin可升高血糖[18]。目前，普遍认为当人或动物饥饿时Ghrelin水平升高，而在饱腹后Ghrelin水平下降，但是在反刍动物牛和羊可能由于其胃排空相对单胃动物慢，因而在短期禁食时并不表现Ghrelin水平升高[19]。羊和牛属于多胃动物，而人类和鼠属于单胃动物，推测Ghrelin对血糖调控可能在单胃动物和多胃动物之间也存在差异，其机理有待进一步探究。

本研究结果显示，羔羊在禁食后基本生命体征和血糖水平下降，在急性冷暴露情况下心率加快，血糖浓度升高，而呼吸频率减慢，但禁食羔羊无论处于室温还是急性冷暴露情况下，外源性Ghrelin并不影响其基本生命体征和血糖浓度，提示羔羊在禁食和低温情况下可通过调整自身活动，以维持机体稳态，并且Ghrelin可能并未参与该调整过程。

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Effects of Fasting，Cold Exposure and Exogenous Ghrelin Injection on Physiological Indexes in Lambs

WANG Qin1，ZHAO Hong-qiong1，XU Qin2，HOU Yu1，KALIBIXIATI·Aimulajiang1，YAN Shu-ping1，YAO Gang1，LIU Jiang-wei2，ZHANG Dan1，WANG Li-fang1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi，Xinjiang，830052，China；2.DepartmentofLaboratoryAnimalScience,GeneralHospitalofXinjiangMilitaryRegion，Urumqi，Xinjiang，830000，China)

In order to explore the effect of acute cold exposure and exogenous injection of ghrelin on physiological indexes of lambs,basic vital signs,physiological indexes and blood glucose concentration of lambs were monitored after fasting for 24 h,then freezing (-24.7 ℃ ± 0.2 ℃) for 2 h.Moreover,changes of above indexes of lambs by exogenous ghrelin injection were determined.The results showed that breathing rates,heart rates and blood glucose concentrations after fasting for 8 h,16 h and 24 h were significantly decreased compared with that before fasting (P<0.05).Rectal temperature after fasting for 16 h and 24 h were significantly reduced compared with that before fasting (P<0.01),however,blood physiological indexes had no changes during the fasting period (P>0.05). Breathing rates after cold exposure for 1.5 h and 2 h were slowed compared to warm groups (P<0.05),however,heart rates and blood glucose concentrations after cold exposure for 1.0 h,1.5 h and 2 h were significantly increased (P<0.05).Changes of above indexes were not found by intravenously injecting ghrelin after 2 h of cold exposure (P>0.05).These results indicated that lambs in the fasting and low temperature conditions can adjust their activities to maintain the body homeostasis,and ghrelin may not be involved in the process.

fasting; cold exposure; ghrelin; lamb; blood glucose

2016-08-01

国家自然科学基金项目(31560684；31201872)

王 琴(1989-)，女，新疆塔城人，硕士研究生，主要从事动物生理学研究。△同等贡献作者。

S852.21

A

1007-5038(2017)04-0040-06

*通讯作者