人工栽培铁皮石斛及其市售干品品质比较与HPLC指纹图谱分析

李杰，何梅，王再花*

(1.广东省农业科学院环境园艺研究所/广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室，广东广州510640;2.华南师范大学生命科学学院/广东省植物发育生物工程重点实验室，广东广州510631)

人工栽培铁皮石斛及其市售干品品质比较与HPLC指纹图谱分析

李杰1，何梅2，王再花1*

(1.广东省农业科学院环境园艺研究所/广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室，广东广州510640;2.华南师范大学生命科学学院/广东省植物发育生物工程重点实验室，广东广州510631)

比较不同产地铁皮石斛品质差异，建立HPLC指纹图谱，对其质量控制提供参考。以29份来自云南、浙江、湖南、广西和广东不同栽培产地的铁皮石斛(25份鲜条、4份市售干条和枫斗)为试材，比较了其多糖和醇溶性浸出物含量，并利用HPLC法建立了铁皮石斛指纹图谱。结果表明，样品间多糖含量和醇溶性浸出物含量差异显著，有1份样品的多糖含量和4份样品的醇溶性浸出物含量未达到中国药典的标准。HPLC指纹图谱分析发现29份样品共有13个共有峰，除1份云南样品与对照图谱的相似度为0.676外，其余样品与对照图谱相似度均在0.751～0.934。依据共有峰峰面积聚类分析发现仅少数来源地相近的铁皮石斛样品能优先聚类，而多糖含量、醇溶性浸出物含量与相似度间并没有明显的相关性。不同产地的人工栽培铁皮石斛及其市售干品品质差异较大，铁皮石斛HPLC指纹图谱含13个共有峰，利用该图谱可以对铁皮石斛进行质量评价。

铁皮石斛;多糖;醇溶性浸出物;HPLC指纹图谱

铁皮石斛(Dendrobium officinale)是兰科石斛属的多年生草本植物，我国传统的名贵中药材，富含多糖、氨基酸和微量元素等多种化学成分，具有有健脾养胃、滋阴补肾、润肺生津等功效［1－3］，现代药理研究也证明，铁皮石斛还具有增强机体的免疫能力［4］、抗氧化［5－6］、抗肿瘤［7］、降低血糖［6，8］、镇痛消炎［9］等作用，药用保健价值高。目前铁皮石斛在秦岭淮河以南的诸多省区都有分布和栽培，云南和浙江的栽培面积较大，而由于产地、生态环境和栽培管理的不同，产品质量和化学成分也存在差异，2010年版《中国药典》就对其多糖和醇溶性浸出物含量提出了明确要求［10］。为有效地比较和控制铁皮石斛产品质量，邓星燕等［11］建立了利用紫外光谱快速鉴别云南省不同产地铁皮石斛的方法，何铁光等［12］分析了广西省内13份铁皮石斛新鲜茎的HPLC指纹图谱，而刘文杰等［13］和崔娟等［14］则主要分析了云南省内不同产地铁皮石斛新鲜茎的HPLC指纹图谱分析，而有关湖南、广东等地栽培的铁皮石斛以及市售铁皮石斛干条和枫斗的报道甚少。本研究参考《中国药典》标准，同时比较测定了25份来自云南、浙江、湖南、广西和广东不同来源的铁皮石斛新鲜茎以及4份市售干条和枫斗样品的多糖和醇溶性浸出物成分含量，并利用HPLC指纹图谱法进行了比较研究。比较不同来源的人工栽培铁皮石斛及其市售干品品质，建立HPLC指纹图谱，并对其品质进行比较评价，以期对铁皮石斛质量现状和质量控制提供参考。

表1 铁皮石斛编号及其来源Table 1 Numbers and locations of Dendrobium officinale samples

1 材料与方法

1.1 供试材料

采集于不同地点的人工栽培铁皮石斛新鲜茎25份、市售铁皮石斛干条2份和铁皮枫斗2份，共29份样品，60℃烘干，粉碎过60目筛，置干燥器中备用。样品编号及其来源具体见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 HPLC供试样品液制备精密称取铁皮石斛粉末l g于磨口三角瓶中，适量10%氨水润湿，加入甲醇50mL并密闭静置30 min，于85℃下水浴回流提取4 h，趁热过滤，滤液于65℃下旋转蒸发至干后，用5 mL甲醇溶解并定容，过膜过滤得到供试溶液，每样品提取3次作为3个重复。

1.2.2 HPLC色谱分析条件仪器为Aglient1100高效液相色谱仪配紫外检测器和自动进样器，色谱柱:C18液相色谱柱250 mm×4.6 mm，5μm。流动相:乙腈(A)～0.1%磷酸(B)，A+B=100;梯度洗脱A的浓度变化为0～10 min，10%;10～20 min，15%;20～30 min，20%;30～40 min，20%;40～55 min，25%;55～60 min，10%;60～67 min，10%。流速:1.00 mL/min，紫外检测器波长为310 nm，进样体积:20μl。

1.2.3 多糖含量与醇溶性浸出物含量测定多糖参考《中国药典》2010年版的方法进行测定分析［10］，每份样品测定3次，取其平均值。醇溶性浸出物含量照《中国药典》2010年版一部附录XA项下热浸法测定［10］，用乙醇做溶剂，每份样品测定3次，取其平均值。

1.2.4 数据分析数据利用SAS进行方差分析和聚类分析，指纹图谱数据应用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(《国家药典委员会》2004A版)软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛共有峰的标定与对照指纹图谱的生成

运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2004A版软件对不同来源的29份铁皮石斛样品HPLC指纹图谱进行多点校正，再进行相似度分析和匹配分析，并匹配后生成对照指纹图谱。从图1可以看出，29份样品共有13个共有峰，其中11和12号峰的峰面积相对大些。

2.2 相似度比较

利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2004A版软件，计算不同产地的29份铁皮石斛样品间指纹图谱的相似度和与对照指纹图谱的相似度(表2)。各产地样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度在0.676～0.934，除S15样品的相似度略低外，其余样品的相似度均在0.75以上，其中10个样品的相似度达在0.90以上，相似度较好。

2.3 不同来源铁皮石斛多糖和醇溶性浸出物含量比较

图1 29份铁皮石斛样品指纹图谱的匹配分析Fig.1 Fingerprintsmatching analysis of 29 Dendrobium officinale

表2 29份铁皮石斛的多糖含量、醇溶性浸出物含量与相似度Table 2 Polysaccharide content，alcohol soluble extract content and similarity of29 Dendrobium officinale samples

由表2可以看出，铁皮石斛的2种主要成分存在较大差异。29份样品中，18份样品的多糖含量超过40.0%，其中S16的多糖含量最高，为55%，显著高于其他样品，而S17、S18和S20次之，三者的多糖含量也达到了44%以上，而S15最低，仅24.3 %。醇溶性浸出物方方面，有13份样品均超过10.0%，最高为S25，达27.2%，显著高于其他样品，而S29最低，显著低于其他样品。参考2010版《中国药典》的标准，铁皮石斛多糖含量不得少于25.0 %，醇溶性浸出物含量不得少于6.5%，本研究中的29份样品多糖含量仅S15低于该标准，多糖含量达标率为96.6%，而S2、S20、S22和S29 4份样品(包含1份市售干条和1份枫斗)的醇溶性浸出物含量低于该标准，醇溶性浸出物含量达标率为86.2 %。

2.4 聚类分析

HPLC指纹图谱反映了铁皮石斛中的大部分化学成分信息，而峰面积的大小则表明化学成分含量的高低。将29份样品的13个共有峰峰面积利用SAS软件进行聚类分析，其结果如图2所示。29份样品聚为3类，S4、S14和S21为第1类群，其中S4和S14都来自广西都峤山，而S21为浙江药店。S3、S10和S18为第2类群，其余样品为第3类群。在第3类群中，S9、S11和S12均来自广西，且先聚在一起。S5、S26、S13和S7先聚在了一起，四者均来自云南。S20、S22和S23也优先聚在了一起，其中S20和S23均来自广州清平市场，说明这些来源地相近的铁皮石斛其化学成分含量相似，但其他多数样品未见明显的规律。

图2 不同产地铁皮石斛聚类分析图Fig.2 Clustering analysis of Dendrobiumofficinale produced from different areas

3 讨论

因气候条件和栽培技术的不同，不同地域栽培的铁皮石斛主要化合物成分含量存在显著差异，俞巧仙等［15］研究了铁皮石斛多糖和醇溶性浸出物含量的动态变化规律，证实当以多糖与醇溶性浸出物总量为目标时以春芽萌动至开花前采收为宜，本研究中样品于12月份采收，与其时期一致。诸燕等［16］研究发现浙江省内不同产地的13份2年生铁皮石斛的多糖含量在25.63%～41.65%，而刘文杰等［13］也发现云南省内不同产地的6份铁皮石斛多糖含量在30.63%～35.87%，而醇溶性浸出物含量在7.92%～13.65%，且以勐海栽培的含量最高。本研究进一步扩大了样品数及其栽培范围，发现铁皮石斛的差异更大，29份样品的多糖含量在24.3%～55%，多糖含量高于40%的样品主要来至浙江、广西和广东产地，而低于30%的样品则广西、云南和浙江产地均有。29份样品的醇溶性浸出物含量在4.0%～27.2%，含量较高的几份样品来自云南、浙江和广西。2份湖南样品的这2个指标基本处于中等水平。对4份市售铁皮石斛干品和枫斗的比较发现，多糖含量均符合《中国药典》的标准，且3份含量在40%以上，但醇溶性浸出物含量则有2份未达到《中国药典》6.5%的标准［10］，因此，基于对市售铁皮石斛质量的监管，醇溶性浸出物含量的检测显得更为重要。

HPLC指纹图谱的直观比较，能够反映各化学成分的有无和含量高低，从而判断样品的一致性情况。何铁光等［12］分析13份广西栽培的铁皮石斛，有12份相似度均在0.7以上，1份仅为0.604;刘文杰等［13］发现6份云南栽培的铁皮石斛相似度在0.8以上。本研究中来自5个不同栽培省份的29份铁皮石斛共找到13个共有峰，其中28份样品的相似度在0.75以上，而4份枫斗和干品的相似度在0.751～0.914，说明铁皮石斛鲜条、干条和枫斗的品质都存在差异。样品S15相似度最低(0.604)，该样品的多糖含量也最低(24.3%)，而将所有样品的多糖含量、醇溶性浸出物含量以及与对照指纹图谱的相似度进行分析，未见明显的相关性。

4 结论

不同产地的29份人工栽培铁皮石斛及其市售干品在多糖含量和醇溶性浸出物含量上差异显著，基于上述样品构建的铁皮石斛HPLC指纹图谱含13个共有峰，利用该图谱可以对铁皮石斛进行质量评价。

参考文献:

［1］章金辉，王再花，李杰，等.大苞鞘石斛与铁皮石斛主要活性成分比较分析［J］.热带作物学报，2015，36(12):2192－2197.

［2］张爱莲，魏涛，斯金平，等.铁皮石斛中基本氨基酸含量变异规律［J］.中国中药杂志，2011，36(19):2632－2635.

［3］黎万奎，胡之璧，周吉燕，等.人工栽培铁皮石斛与其他来源铁皮石斛中氨基酸与多糖及微量元素的比较分析［J］.上海中医药大学学报，2008，22(4):80－83.

［4］Xia L J，Liu X F，Guo H Y，et al.Partial characterization and immunomodulatory activity of polysaccharides from the stem of Dendrobium officinale(Tiepishihu)in vitro［J］.Journal of Functional Foods，2012，4(1):294－301.

［5］王再花，章金辉，李杰，等.3种药用石斛多糖的抗氧化活性比较研究［J］.华南师范大学学报，2015，47(5):65－70.

［6］Pan L H，Li X F，Wang M N，et al.Comparison of hypoglycemic and antioxidative effects of polysaccharides from four different Dendrobium species［J］.International Journal of Niological Macromolecules，2014，64:420－427.

［7］何铁光，杨丽涛，李杨瑞，等.铁皮石斛原球茎多糖DCPP1a-1的理化性质及抗肿瘤活性［J］.天然产物研究与开发，2007，19:578－583.

［8］吴昊姝，徐健华，陈立钻，等.铁皮石斛降血糖作用及其机制的研究［J］.中国中药杂志，2004，29(2):160－163.

［9］侯少贞，李焕彬，郭建茹，等.铁皮石斛镇痛与抗炎作用研究［J］.动物医学进展，2012，33(10):49－52.

［10］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.第二部.北京:中国医药科技出版社，2010:265－266.

［11］邓星燕，张霁，王元忠，等.不同产地铁皮石斛紫外指纹图谱鉴别分析［J］.云南大学学报(自然科学版)，2014，36(6):912－919.

［12］何铁光，卢声仙，王爱勤，等.广西铁皮石斛HPLC指纹图谱研究［J］.天然产物研究与开发，2012，24:353－358，320.

［13］刘文杰，孙志蓉，杜远，等.不同产地铁皮石斛主要化学成分及指纹图谱研究［J］.北京中医药大学学报，2012，36(2):117－120.

［14］崔娟，杨柳，谭仕杰，等.铁皮石斛HPLC指纹图谱研究［J］.中国药学杂志，2013，48(19):1673－1676.

［15］俞巧仙，郭英英，斯金平，等.铁皮石斛多糖和醇溶性浸出物动态累积规律研究［J］.中国中药杂，2014，39(24):4769－4772.

［16］诸燕，斯金平，郭宝林，等.人工栽培铁皮石斛多糖含量变异规律［J］.中国中药杂志，2010，35(4):427－430.

(责任编辑 陈虹)

Quality Com parison and HPLC Fingerprints Analysis of Cultivated Dendrobium officinale and Its Dried Commodities

LI Jie1，HE Mei2，WANG Zai-hua1*
(1.Environmental Horticulture Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Lab of Ornamental PlantGermplasm Innovation and Utilization，Guangdong Guangzhou 510640，China;2.College of Life Science，South China Normal University/Guangdong Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development，Guangdong Guangzhou 510631，China)

Comparing the quality differences of Dendrobium officinale from different areasand establishing the HPLC fingerprintsof D.officinale were conducted to provide a reference for quality control.The polysaccharide contentand alcohol soluble extract content of29 D.officinale(25 fresh samples and 4 dried samples and Fengdou)from different cultivation areaswere evaluated，and their fingerprintswere established using HPLCmethod.The results showed that29 sampleshave significant differences in the contentofpolysaccharidesand alcoholsoluble extracts，butpolysaccharide contentof one sample and alcoholsoluble extractcontentof four sampleswere below the standardsof the Chinese pharmacopoeia.HPLC fingerprints indicated therewere13 common peaks among29 samples.The similarity of HPLC fingerprintsof D.officinale was higher(between 0.751 and 0.934)except one Yunnan sample was0.676.Clustering analysis indicated a few D.officinale with similar sourceswere priority clustering，and no correlation was found among the polysaccharide content，alcohol soluble extract content and similarity.The qualitieswere diverse among the D.officinale samples from different areas.HPLC fingerprints of D.officinale contained 13 common peaks，which could be used for quality evaluation of D.officinale.

Dendrobium officinale;Polysaccharides;Alcohol soluble extract;HPLC fingerprints

S567

A

1001－4829(2017)2－0262－05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.2.004

2016－03－20

广东省科技计划项目(2013B090600147和2013B0 20302011);国家青年基金项目(31400597)

李杰(1983－)，男，湖南常德人，博士，助理研究员，研究方向为植物栽培生理与遗传育种，*为通讯作者，E-mail:wangzaihua@163.com。