炭疽实验室生物安全

谢双,靳晓军,李京京,程洪亮,陆兵

军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100071

炭疽实验室生物安全

谢双,靳晓军,李京京,程洪亮,陆兵

军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100071

近年来，炭疽自然疫情和实验室相关事故频发，有关炭疽生物安全问题再次引发关注。本文简要介绍炭疽芽胞杆菌基本特点和目前对炭疽的治疗及预防概况，再结合历年来炭疽实验室典型生物安全事故，分析并总结国内外实验室生物安全管理的经验教训，针对性地提出炭疽实验室管理问题及对策，供炭疽实验活动和实验室生物安全管理参考。

炭疽芽孢杆菌；炭疽；实验室事故；炭疽实验室生物安全

2016年8月初，俄罗斯西伯利亚亚马尔-涅涅茨自治区暴发炭疽疫情，造成1名儿童死亡，90多人接受入院治疗，2500头以上的驯鹿死亡[1]。近年来，国内外相继报道过不同程度、不同原因的自然发生的炭疽疫情[2]。同时，炭疽实验室事故也频频发生，给周围环境和人员带来巨大的生物安全隐患。本文介绍了炭疽及炭疽芽胞的基本情况和目前对炭疽这一古老疾病的治疗研究进展，并以炭疽为例，讨论高致病性病原微生物实验室生物安全问题及对策。

1 炭疽芽胞杆菌

1.1 炭疽芽胞杆菌基本特性

早在19世纪，罗伯特·科赫就根据炭疽提出了著名的科赫法则，并由此向世人证明了炭疽芽胞杆菌就是炭疽病的病原菌。炭疽芽胞杆菌是革兰阳性杆菌，通常直径为1～1.5μm，长3～10 μm，在显微镜下呈“车箱”似的链条状连在一起。炭疽芽胞杆菌无运动性，能在血平板上快速生长、无溶血环，特定条件下形成芽胞。炭疽芽胞菌落为灰白色不规则圆形，直径4～5 mm，菌落边缘呈毛玻璃状。在活体组织中炭疽芽胞杆菌不会形成芽胞，但是当感染后的机体组织暴露于空气中，炭疽芽胞杆菌就会很快形成芽胞。而一旦形成芽胞，其致病性和感染性就会大大增加。

相对于多数细菌繁殖体，由炭疽芽胞杆菌等所形成的芽胞能高效抵抗一系列致死性处理，如脱水、高温、紫外线照射、大量有毒化学剂及蛋白酶和溶菌酶的酶解[3]。因此，炭疽芽胞在休眠状态时在自然界能保持几十年甚至几百年的生存能力，一旦环境条件合适，芽胞在几小时内就会出芽并快速增殖。这次西伯利亚炭疽疫情暴发的“始作俑者”就是在地下休眠了75年的炭疽芽胞[1]。炭疽芽胞的稳定性及方便储存和运输等特点，也是其作为生物武器或生物恐怖剂应用的主要原因之一。

1.2 炭疽芽胞杆菌致病机理

炭疽芽胞杆菌的毒力基因决定簇位于2个独立于染色体外的大质粒pXO1和pXO2上，这2个质粒分别编码炭疽毒素和聚D-谷氨酸荚膜。炭疽毒素由3种共同起作用的蛋白质组成，即水肿因子、保护性抗原和致死因子。当保护性抗原与水肿因子和致死因子结合后，就会对宿主细胞产生毒性，并在感染组织（如肺部）产生液体（水肿）。水肿因子是一种腺苷酸环化酶，它能促进环腺苷酸的聚集，造成机体水和离子代谢的失调。致死因子是金属肽酶，它能切断蛋白质信号转导途经，严重影响免疫应答所必需的细胞功能并造成细胞死亡[4]。毒素蛋白的组合能抵御宿主的防御并干扰细胞功能；聚合氨基酸荚膜能够保护炭疽芽胞杆菌免受吞噬细胞的攻击，两者结合能给宿主带来致命的伤害。即使在使用抗生素杀死了病人体内的细菌后，炭疽毒素的作用仍能夺走病人性命。

2 炭疽及其防治

炭疽是一种人畜共患的急性传染病，根据感染的方式可分为体表感染型（皮肤）炭疽、经口感染型（肠）炭疽、吸入感染型（肺）炭疽、脑膜炎型炭疽、炭疽败血症[5]，以及近年来西欧部分国家陆续出现的因注射海洛因引起的注射型炭疽[6]。

2.1 炭疽的临床治疗

针对炭疽病原治疗，通常推荐环丙沙星（或青霉素G）+克林霉素联合用药；疑似出现脑膜炎并发症的推荐用药为环丙沙星（或青霉素G）+美罗培南+利奈唑胺联合用药。以上疗程至少2～3周，直到满足临床稳定性标准[7]。

针对皮肤炭疽的局部治疗，可用1∶10 000高锰酸钾冲洗，并敷以抗生素软膏。为防止败血症的发生，切忌按压皮肤病灶及外科手术。

2.2 炭疽疫苗

1954年，前苏联首先筛选出人用减毒活疫苗STI，并投入临床使用。我国于1958年研制成功A16R减毒活疫苗，并在1961年开始由兰州生物制品研究所生产[8]。该菌株无荚膜质粒，主要成分是培养形成的炭疽芽胞，接种方式为皮上划痕，但存在接种剂量难以保证等问题，每年须加强接种1次。美国上世纪50年代就开始炭疽疫苗的研究，1970年，美国FDA批准通过了人用炭疽疫苗AVA（anthrax vaccine absorbed），所使用的是有毒素质粒而没有荚膜质粒的V770-NP1-R株。该疫苗的接种方式为18个月内肌内注射6次，然后每年加强接种1次。AVP（anthrax vaccine precipitated）是英国上市的人用炭疽疫苗，所使用的是Sterne菌株。但这些疫苗均成分复杂，批间变异大，难定性定量，不能完全有效地预防一些特定的炭疽菌株。

总的来说，目前的人用炭疽疫苗仍会带来一些令接种者难以接受的副反应，有效免疫保护力的持续时间也比较短，需要每年都进行加强性免疫接种，尤其对吸入型炭疽感染保护不佳。目前新型炭疽疫苗如保护性抗原（PA）组分疫苗、DNA疫苗[9]等的设计策略都主要考虑疫苗的成分是否更加稳定、更加可控，是否有更高的保护率以及更简单的接种程序。

3 炭疽实验室生物安全事故及分析

自然发生的炭疽疫情通常发生在处理感染性动物或动物产品（如羊毛、羊皮）的人群中，发病表现出明显的职业接触特点，多数患者为农牧民、皮毛加工及运输工人、屠宰厂工人等职业人群，而且多为皮肤炭疽。

相对于自然发生的炭疽疫情，炭疽实验室获得性感染的途径和种类就复杂许多，主要包括：①注射器、针头等锐器刺伤可能引起的皮肤炭疽感染；②工作人员皮肤裸露操作感染性炭疽样本可能引起的直接接触感染；③不戴口罩操作或实验区喝水等危险行为可能引起的肠炭疽感染；④炭疽芽胞气溶胶可能引起的吸入性炭疽感染。

3.1 典型炭疽实验室生物安全事故

1979年前苏联斯维尔德洛夫斯克暴发大面积炭疽疫情[10]，据事故相关人员后期的著作描述，系当地生物武器生产基地的炭疽生产车间工作人员卸下排风系统过滤器后未及时安装，只留下一张纸条告知下一班工作人员，而第二天上班的同事未做处理就开始工作，使得车间在排风系统没有安装过滤器的情况下运行，导致含炭疽芽胞的粉尘直接排出车间，污染了周边环境，直接导致大量人员感染并致死。

1991年，美国马里兰一军方实验室发现丢失了27份样本，样本主要为感染炭疽和埃博拉的动物组织，并且至今仍不知这些样本的去向。该实验室还在周末和晚上未经授权的情况下开展炭疽实验[11]。

2001年9月和10月，至少有5封装有大量炭疽芽胞的信件分别邮寄给了位于哥伦比亚特区的美国参议员以及位于纽约市和佛罗里达州博卡拉顿市的媒体机构[12]。邮件至少使22人感染炭疽，5人死亡。美国当局最终在2010年得出结论，即美国陆军传染病医学研究所（USAMRIID）布鲁斯·E·埃文斯博士利用实验室保存的炭疽菌株恶意制造了这场炭疽邮件事件，证据之一是布鲁斯有大量时间单独留在生物安全三级实验室，并无法提供充分的工作理由。

2002年，美国实验室人员将炭疽样本带出高等级生物安全实验室之前，未按照正确的消毒灭菌方法处理，导致炭疽样本在未完全失活的情况下被携出实验室，而样本接收者在有外伤并且未戴手套的情况下转移炭疽样本瓶，事故最终导致1人感染炭疽，实验室外环境也可能存在污染风险[13]。事实上，类似事件层出不穷。2014年6月5日，美国亚特兰大CDC的实验人员在BSL-3实验室对活炭疽进行灭活时，没有遵循正确程序，导致残留活炭疽，并且在没有有效防护的情况下将活炭疽转移到了其他2个BSL-2实验室，而这2个实验室并不具备处理活炭疽的条件[14]。BSL-2实验室的工作人员也是在没有穿戴适当个体防护装备的条件下处理这些认为已经灭活的炭疽样本。6月13日，一名工作人员意识到这些炭疽芽胞可能未完全灭活后立即报告，CDC随即开展相关调查，并终止了所有的实验室活动。截止到6月20号，证实有86人接触到致命炭疽杆菌。

2011年，美国芝加哥一名实验室工作人员在实验结束几天后，皮肤表面出现由含有炭疽毒力大质粒的蜡样芽胞杆菌导致的严重感染。据查，实验室未将这些危险菌种归到管制剂范围内，管理相对松散，最终导致了事故的发生[15]。

2012年3月，英国萨利郡动物卫生和兽医实验室的研究人员打算将加热灭活的炭疽样本递送至位于贝尔法斯特的分部，但是他们不小心混淆了炭疽样本管，最后北爱尔兰分部收到的样本不是灭活的炭疽材料，而是有活性的甚至可能会致命的活炭疽样本。幸运的是，贝尔法斯特实验室的人员是在高等级生物安全实验室操作的这些样本，因此没有造成暴露。而另一个动物卫生和兽医实验室的2名工作人员则是在开放环境中处理了活炭疽样本，幸运的是2人均事前接种了炭疽疫苗，也未因此感染[16]。

2015年5月，美国五角大楼公开承认在过去的10年间，设于犹他州的达格威试验场至少向韩国境内外51个实验室递送了可能有活性的炭疽杆菌样本。马里兰州的一个实验室在2015年5月22日才发现收到的炭疽样本仍有活性，而2006年时就有实验室收到过这种可能仍有活性的样本[17]。据调查，可能是实验室监管检测及样本的输出环节出现了严重失误。截至目前，没有任何迹象表明这是一起人为故意事件[18]。

3.2 炭疽实验室事故分析

上述前苏联大面积炭疽污染事故，是典型的管理体系出现的漏洞。首先，该实验室没有明确过滤器更换的操作规程，或者工作人员没有按照操作规程执行，而实验室应有机制确保过滤器恢复前禁止生产；其次是工作交接环节上的问题，工作人员应该通过工作日志交接而不是用一张纸条。细节上的失误导致了重大事故的发生。

2002、2014、2015年美国发生的炭疽实验室事故，均是由炭疽材料灭活不彻底造成的，这也是美国报道的炭疽实验室事故最多的原因之一，不得不引起重视。接触高致病性病原微生物样本，人员的基础防护必不可少，必要时还应采取预防措施。这些事件充分表明了验证并严格执行生物安全实验室标准操作规程，特别是消毒灭菌操作规程和个体防护操作规程的重要性。我国2004年的“非典”实验室事故也是缘于使用了未经验证的病原微生物灭活程序。

除了管理体系和标准操作规程等环节上的问题，人员管理更是生物安全实验室管理的重中之重。生物安全实验室的安保-防止病原微生物的恶意使用，其最薄弱环节来自内部人员，2001年的美国炭疽邮件事件就是由实验室工作人员实施的。据分析，该实验室的视频监控系统和报警系统并不完善，工作人员可以单独在生物安全三级实验室工作，而且管理层也未及时关注工作人员的心理活动、精神状况等，最终酿成重大生物安全事故。此外，人员主观因素也会给生物安全实验室带来风险，如上述事件中英国发生混淆活炭疽样本事件以及美国军方丢失样本事件等。这些事件不仅揭露了实验室样本管理混乱的现象，同时表明了工作人员主观上也不具备高度的责任意识和安全意识。

4 炭疽实验室生物安全管理对策

以上炭疽实验室事故表明，生物安全实验室除了需要重视硬件建设以外，更要重视实验室管理。结合我国生物安全实验室管理现状，提出以下实验室生物安全管理对策，供从事炭疽研究的实验室参考。

4.1 完善并严格执行实验室管理制度

从事高致病性病原微生物实验活动，必须有法可依，有章可循。实验室应完善并严格执行实验室管理制度，禁止一切管理体系之外的行为。除此之外，加强人员培训，保证实验室工作人员理解并充分掌握所有的规章制度，不能出现因理解能力的参差不齐，造成巨大的生物安全隐患。

4.2 制定可靠的标准操作规程并严格过程控制

按照国家的管理要求，目前生物安全实验室都应该建立管理体系，制定操作规程。涉及病原微生物操作，特别是消毒灭菌的标准操作规程是否能够有效地灭活病原微生物，除了应对操作规程本身进行验证以证明其可靠以外，还应严格过程控制。在验证过程中，重点关注的是要充分考虑实际操作时的各种影响因素，以排除对操作规程有效实施的干扰，并达到最终目的；在实际操作过程中，则应做好必要的记录以及对识别出的关键参数的监控，以确保操作规程的有效实施。只有事先充分验证、过程严格控制的程序，才能充分保证实验室生物安全。

4.3 确保基础的人员防护和医疗监护

生物安全实验室的风险来自所操作的病原微生物，要确保安全，离不开基础的人员防护和医疗监护。人员防护的重点是有效隔离，基础的人员防护必须做到佩戴手套和生物防护口罩，同时保证所有样本操作均在生物安全柜等防护条件下进行，这样可以避免绝大多数意外的发生。对于从事高致病性病原微生物操作的工作人员，基础的医疗监护（体温监测等）、有条件时接种疫苗，都是防止、监测实验室暴露和感染，避免实验室事故的有效手段。

4.4 加强实验室工作人员安全责任意识

人员管理是生物安全管理的重中之重。凡是操作高致病性病原微生物的工作人员，除应掌握相关专业知识和操作技能外，还须具备高度的责任意识及安全意识。保证实验室生物安全是能力建设，长期保证实验室生物安全则是思想建设。在加强生物安全教育、培训，实现生物安全的基础上，保证生物安全意识不松懈，执行生物安全管理不懈怠，同样是实验室生物安全管理的难题。实验室可以通过定期进行实验室生物安全事故的警示教育、实验室生物安全岗位培训及考试、实验室生物安全研讨或沙龙等多种方式，促进工作人员持续保持高度的安全责任意识。

4.5 落实实验室生物安保措施

实验室生物安保措施是指一系列旨在防止病原微生物本身及其相关信息被滥用或恶意使用的预防性措施。实验室生物安保的物理措施包括监控摄像系统、报警入侵系统及严格的来访人员控制系统，这主要是针对外部入侵的。而内部环节中的人员安保措施则包括严格审查一切能接触到病原微生物材料的内部人员的忠诚度，并实时跟踪其心理活动及思想波动；内部环节中生物样本的安保则包括菌（毒）种的双人双锁制度、高等级生物安全实验室内的双人工作制度、样本进出实验室的严格登记制度等。在生物安保方面，防止外部入侵技术要求高，出现问题往往也能及时发现；而如何有效地防止内部环节出现问题，则需要借助于制度建设以及润物细无声的日常工作，任务更为艰巨。

从古至今，无论是自然发生还是在生物武器、生物恐怖以及实验室生物安全等方面，炭疽都是一种“热门”的生物剂，也对人类健康和经济造成了严重危害。但炭疽并不可怕，随着人类对炭疽的深入了解，炭疽这一古老的疾病已在人类可控范围内，而科学防控也将有助于我们避免炭疽造成的危害。

[1]俄北西伯利亚暴发炭疽疫情 一男童死亡数十人感染[EB/OL].http://news.xinhuanet.com/world/2016-08/04/c_ 129202004.htm.[2016-08-04]

[2]谢刚,张国明,温念平,等.2005-2011年红原县炭疽疫情流行特征分析[J].预防医学情报杂志,2014,30(2): 114-116.

[3]United States Department of Justice.Amerithrax Investigative Summary.February 19,2010[Z].http://www.justice.gov/amerithrax/docs/amx-investigative-summary.pdf.

[4]National Research Council.Review of the Scientific Approaches Used during the FBI's Investigation of the 2001 Anthrax Letters.2011[Z].http://dels.nas.edu/ resources/static-assets/materials-based-on-reports/reports-in-brief/Anthrax-Report-Brief-Final.pdf.[2016-08-04]

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[17]Sisk R.Carter Apologizes for Secret Anthrax Shipments to South Korea[EB/OL].http://www.military.com/ daily-news/2015/06/01/carter-apologizes-for-secret-anthrax-shipments-to-south-korea.htm l(Jun.01,2015).

[18]U.S.military sent live anthrax to labs by accident[EB/OL]. http://mashable.com/2015/05/28/live-anthraxshipped-usmilitary/#4sC2UpOJziqQ.

Laboratory Biosafety of Anthrax

XIE Shuang,JIN Xiao-Jun,LI Jing-Jing,CHENG Hong-Liang,LU Bing*

Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100071,China

*Corresponding author,E-mail:13693506666@163.com

In recent years,the breakout of natural anthrax epidemic and occurrence of laboratory accidents made the biosafety of anthrax come into our view again.The characteristics of anthrax andBacillus anthracisas well as the advances in the treatment and preventive vaccination of anthrax were briefly introduced,followed by the analysis of the biosafety accidents and the experience of anthrax laboratories management at home and abroad. Finally,some strategies and suggestion were put forward as lab staff's reference to strengthen the management of laboratory biosafety of anthrax andB.anthracis.

anthrax;Bacillus anthracis;laboratory accidents;laboratory biosafety of anthrax

R378

A

1009-0002（2017）03-0347-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.021

2016-10-17

谢双（1991-），女，硕士研究生，（E-mail）18766178741@163.com

陆兵，（E-mail）13693506666@163.com