反相高效液相色谱法同时测定苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平的血药浓度

荣 荣，邹广杰，张启丽，邹良宏#，李明泉，张美燕，于治国#

(1.沈阳药科大学药学院，辽宁 沈阳110016； 2.辽宁省复员军人康宁医院癫痫病医院/兴城市癫痫病专科医院神经内科，辽宁 兴城 125100)

反相高效液相色谱法同时测定苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平的血药浓度

荣 荣1*，邹广杰2，张启丽1，邹良宏2#2，李明泉2，张美燕1，于治国1#1

(1.沈阳药科大学药学院，辽宁 沈阳110016； 2.辽宁省复员军人康宁医院癫痫病医院/兴城市癫痫病专科医院神经内科，辽宁 兴城 125100)

目的：建立同时测定苯巴比妥、苯妥英钠和卡马西平血药浓度的反相高效液相色谱法。方法：采用Diamonsil Sum C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈∶水(V∶V=33∶67)，检测波长为230 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为30 ℃，进样量为20 μl。结果：苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平的血药浓度在1.0～80.0 μg/ml范围内呈良好的线性关系(r>0.99)，日内和日间精密度RSD均<15%，平均回收率分别为92.2%、89.1%和89.4%。结论：该法简便、快速，结果准确、可靠，可用于苯巴比妥、苯妥英钠和卡马西平的临床血药浓度监测。

苯巴比妥； 苯妥英钠； 卡马西平； 血药浓度； 反相高效液相色谱

苯巴比妥(phenobarbital，PPB)、苯妥英钠(Phenytoin，PHT)、卡马西平(carbamazepin，CBZ)是临床上常用的抗癫痫药[1]。上述药物治疗浓度范围窄，其抗癫痫作用和不良反应与血药浓度密切相关，且个体差异较大，易发生毒性反应，因此，需常规监测其血药浓度，从而合理调整用药剂量，以提高疗效、减少不良反应的发生[2-4]。目前，国内测定PPB、PHT、CBZ血药浓度的高效液相色谱法已有较多报道[5-11]。本研究在文献报道方法的基础上建立并验证了一种简便、快速、准确的反相高效液相色谱法同时测定人血清中PPB、PHT、CBZ的浓度，为临床合理用药提供客观依据。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪(包括二元泵、柱温箱、在线脱气机、色谱工作站，北京普析通用有限公司)；800型离心机(江苏金坛城西晓阳电子仪器厂)；XW-80A型涡旋混合器(江苏海门市麒麟医用仪器厂)；HGC-12型氮吹浓缩仪(天津恒奥仪器设备有限公司)。

1.2 药品与试剂

PPB对照品(批号：171222-200605，纯度：99.9%)、PHT对照品(批号：100210-200401，纯度：99.9%)、CBZ对照品(批号：100142-201004，纯度：99.7%)均购自中国药品生物制品检定所；奥美拉唑(纯度>99.0%，沈阳药科大学药剂实验室提供)；甲醇、乙腈(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)；二氯甲烷(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)；水(纯净水，杭州哇哈哈集团有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil Sum C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(V∶V=33∶67)；检测波长：230 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。

2.2 系列标准溶液与内标溶液的配制

取PPB、PHT、CBZ对照品各适量，精密称定，分别置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别得质量浓度为4.0 mg/ml的PPB、PHT、CBZ对照品储备液。分别精密量取PPB、PHT、CBZ对照品储备液适量，置于同一10 ml容量瓶中，加甲醇分别稀释制成PPB、PHT、CBZ质量浓度为10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、400.0和800.0 μg/ml的系列混合标准溶液，于4 ℃冰箱保存，备用[12]。另取奥美拉唑适量，精密称定，用甲醇溶解并定量稀释制成质量浓度为0.1 mg/ml的内标溶液，于4 ℃冰箱保存，备用。

2.3 血清样品的处理

精密量取血清样品200 μl，置于10 ml具塞离心管中，加入内标溶液20 μl与甲醇20 μl，涡旋1 min，加入 pH=7.0的磷酸盐缓冲液200 μl，混匀，加入二氯甲烷 5 ml，2 800 r/min转速下涡旋2 min，3 500 r/min转速下离心5 min，定量移取下层二氯甲烷液2 ml置于5 ml试管中，于40 ℃下氮气流吹干，残留物加初始流动相100 μl复溶，2 800 r/min转速下涡旋混合1 min，4 000 r/min转速下离心5 min，取上清液20 μl进样测定[9]。

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性：取空白血清200 μl，除以甲醇代替内标溶液外，其余按“2.3”项下方法操作，进样20 μl，记录空白血清样品色谱图，见图1(A)；将一定质量浓度的混合标准溶液和内标溶液加入空白血清，依同法操作，得模拟血清样品色谱图，见图1(B)；取联合应用PPB和PHT患者血清200 μl，依同法操作，得PPB/PHT血清样品色谱图，见图1(C)；取联合应用PPB和CBZ患者血清200 μl，依同法操作，得PPB/CBZ血清样品色谱图，见图1(D)。结果显示，在上述色谱条件下，内源性物质和代谢物不干扰血清中PPB、PHT、CBZ及内标物的测定。PPB、PHT、CBZ的保留时间分别为7.8、13.0和14.5 min，内标奥美拉唑的保留时间为9.7 min。

A.空白血清样品；B.模拟血清样品(空白血清加PPB、PHT、CBZ)；C.癫痫患者血样1(服用PPB、PHT)；D.癫痫患者血样2(服用PPB、CBZ)；1.PPB；2.IS；3.PHT；4.CBZA.blank serum；B.simulated serum(blank serum spiked with PPB，PHT，CBZ)；C.serum sample of epilepic 1(taking PPB and PHT)；D.serum sample of epilepic 2(taking PPB and CBZ)；1.PPB；2.IS；3.PHT；4.CBZ图1 HPLC图Fig 1 HPLC chromatograms

2.4.2 标准曲线与范围：取空白血清200 μl，加入系列混合标准溶液 20 μl，分别制成相当于PPB、PHT、CBZ质量浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0和 80.0 μg/ml的模拟血清生物样品，除不加甲醇外，其余按“2.3”项下方法操作，每个质量浓度进行双样本分析，进样20 μl，记录色谱图。以血清中待测物质量浓度(μg/ml)为横坐标(X)，以待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标(Y)，用加权(w=1/x2)最小二乘法进行回归运算，所得的直线回归方程参数见表1。

2.4.3 精密度与准确度：取空白血清200 μl，按“2.4.2”项下方法制成低、中、高质量浓度(2.0、10.0、64.0 μg/ml)的质量控制(quality control，QC)样品，每个浓度进行6样本分析，连续测定3 d，根据当日的标准曲线，计算QC的浓度。对测定结果进行方差分析，考察方法的日内与日间精密度与准确度。结果显示，方法的精密度与准确度良好，符合生物样品分析的相关要求，见表2。

表1 血清中PPB、PHT、CBZ线性回归方程和线性范围Tab 1 Regression equations and linearity range for determination of PPB, PHT and CBZ in serum

表2 精密度及提取回收率试验(n=6)Tab 2 Precision and extraction recovery test(n=6)

2.4.4 提取回收率：取空白血清200 μl，准确加入混合标准溶液适量，制成低、中、高质量浓度(2.00、10.0、64.0 μg/ml)的QC样品各6份，按“2.3”项下方法操作，进样测定峰面积；再分别取同质量浓度的混合标准溶液，直接进样测定。计算经血清样品处理后和未经处理的各被测药物峰面积比，得到提取回收率，结果见表2。

2.4.5 样品稳定性：取空白血清200 μl，按“2.4.2”项下方法制成低、高质量浓度(2.0、64.0 μg/ml)的QC样品，照“2.3”项下方法操作，每个质量浓度进行3样本分析，考察血清样品在不同保存条件下的稳定性。结果显示，QC样品室温(25 ℃)放置4 h、-20 ℃保存15 d和3次冻融循环后测定结果的RSD均≤12%，方法稳定性良好。

2.4.6 临床实例：采用本法监测12例服用抗癫痫药患者的血清药物浓度，其中单用PPB者6例，单用PHT者2例，联合应用PPB与PHT者3例，联合应用PPB与CBZ者1例。按上述方法在同一色谱条件下测得PPB血清浓度范围为12.2～33.4 μg/ml，在PPB的治疗窗范围(10.0～40.0 μg/ml)内；CBZ血清浓度为4.6 μg/ml，在CBZ的治疗窗范围(4.0～12.0 μg/ml)内；服用PHT的患者中，仅1例患者的PHT血清浓度在治疗窗范围(10.0～20.0 μg/ml)内，其余均低于PHT的有效治疗浓度。可见，本法在同一色谱条件下可同时测定PPB、PHT和CBZ的血清浓度，具有灵敏、简便、成本低等特点，可用于临床常用抗癫痫药的血药浓度监测。

3 讨论

多数文献报道，采用高效液相色谱法同时测定PPB、PHT和CBZ血药浓度时，流动相多为甲醇-水系统[12-14]。本实验以乙腈-水(V∶V=33 ∶67)为流动相，克服了以甲醇-水为流动相时背景噪音大及峰形拖尾的缺点，又避免磷酸盐缓冲液对色谱柱及仪器寿命的影响。

本实验在建立方法时选择了220、230、240和254 nm等波长进行试验，结果表明，230 nm波长下内源性物质干扰小且能满足分析组分灵敏度要求，故检测波长选为230 nm。

用甲醇、乙腈等试剂对血清样品进行沉淀蛋白处理，以及用二氯甲烷、乙酸乙酯和乙醚作为萃取溶剂提取血清样品均有报道[10-15]。本实验选择二氯甲烷作为萃取溶剂，提取回收率高、内源性物质峰干扰较少，测定结果准确、重现性良好。

[1]肖润梅，郭珍立，孙敬智，等.高效液相法同时测定血清中卡马西平、苯妥英钠、苯巴比妥的实验方法学研究[J].中国医师杂志，2013，15(10)：1322-1326.

[2]岳一涛，王晓娟，陈艳.抗癫痫药物血药浓度监测180例次结果分析[J].中国基层医药，2012，19(10)：1489-1491.

[3]Serralheiro A，Alves G，Fonuna A，et al.First HPLC-UV method for rapid and simultaneous quantification of phenobarbital, primidone, phenytoin, carbamazepine, carbamazepine-10,11-epoxide, 10,11-trans-dihydroxy-10,11-dihydrocarbamazepine, lamotrigine, oxcar-baze-pine and licarbazepine in human plasma[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2013，925：1-9.

[4]Fortuna A，Bicker J，Alves G，et al.A chiral HPLC-UV method for the quantification of dibenz[b,f]azepine-5-carboxamide derivatives in mouse plasma and brain tissue: eslicarbazepine acetate, carbama-zepine and main metabolites[J].J Sep Sci，2011，34(12)：1391-1401.

[5]易丽昕，马海英，宫雪菲.高效液相色谱法测定人血浆中5种抗癫痫药浓度[J].医药导报，2013，32(11)：1432-1435.

[6]徐家明，周爱华，刘思忠，等.反相高效液相色谱法同时测定血清中苯妥英、卡马西平、苯巴比妥[J].中国医院药学杂志，1991，11(5)：195-198.

[7]杜青云，陈锦珊，黄惠丽.反相高效液相色谱法同时测定三种常用抗癫痫药血清浓度[J].解放军药学学报，2004，20(5)：334-336.

[8]刘颖，王丽，何大可.RP-HPLC法同时测定卡马两平、拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英钠及环氧卡马西平的血清浓度[J].中国临床药理学与治疗学，2005，10(8)：846-851.

[9]周丽娟，边潮.高效液相色谱法同时测定人血清中氨茶碱、苯巴比妥、苯妥英钠及卡马西平的浓度[J].中国医院用药评价与分析，2013，13(7)：621-623.

[10] 孙增先，周金玉，张骞峰，等.反相高效液相色谱法快速测定3种抗癫痫药物血药浓度[J].中国现代应用药学，2004，21(4)：316-318.

[11] 徐玫，赵辉，万绍辉，等.HPLC法同时测定苯巴比妥、苯妥英钠及卡马西平的血药浓度[J].河南大学学报：医学版，2004，23(4)：40-42.

[12] 付成效，毕津莲，李湘斌，等.单步萃取-HPLC法同时测定人血清中3种抗癫痫药浓度[J].中国药房，20ll，22(2)：139-141.

[13] 赵宁，姚妍妍，郭玉梅，等.高效液相色谱法测定3种抗癫痫药物的血药浓度[J].科技信息，2009(23)：446-447.

[14] 李颖.RP-HPLC法同时测定血清苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平的浓度[J].齐鲁药事，2007，26(9)：537-538.

[15] 戴博，张华锋，宋青，等.高效液相色谱-质谱联用法同时测定苯巴比妥、丙戊酸钠、苯妥英钠和卡马西平的血药浓度[J].中国临床药理学杂志，2011，27(3)：213-215.

Determination of Phenobarbita1, Phenytoin and Carbamazepine in Serum by RP-HPLC

RONG Rong1, ZOU Guangjie2, ZHANG Qili1, ZOU Lianghong2, LI Mingquan2, ZHANG Meiyan1, YU Zhiguo1

(1.School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University,Liaoning Shenyang 110016，China； 2.Dept.of Internal Medicine-Neurology， Epilepsy Hospital of Liaoning Demobilized Soldier Kangning Hospital/Epileptic Specialized Subject Hospital of Xingcheng, Liaoning Xingcheng 125100, China)

OBJECTIVE：To establish RP-HPLC method for the determination of phenobarbital(PPB), phenytoin(PHT), carbamazepine (CBZ) in serum. METHODS: The chromatographic column was Diamonsil Sum C18(250 mm×4.6 mm，5 μm), the mobile phase was consisted of acetonitrile-water (V∶V=33 ∶67), with detective wavelength of 230 nm, flow rate of 1.0 ml/min, column temperature of 30 ℃ and sample size of 20 μl. RESULTS: The calibration curves of three analytes were linear over the tested concentration range of 1.0 μg/ml-80.0 μg/ml (r>0.99). The intra-and inter-day precision(RSD) was no more than 15%. The average recovery of PPB, PHT and CBZ were respectively 92.2%, 89.1% and 89.4%. CONCLUSIONS: The method was simple, sensitive and accurate. It was suitable for clinica1 monitoring of PPB, PHT and CBZ in serum.

Phenobarbita1; Phenytoin; Carbamazepine; Serum drug concentration; RP-HPLC

R965

A

1672-2124(2017)03-0374-03

2016-04-10)

*硕士研究生。研究方向：药品质量控制与药动学、中药活性成分与药效物质基础等研究。E-mail：rongr0503@126.com

#通信作者1：教授，博士生导师。研究方向：药品质量控制与药动学、中药活性成分与药效物质基础等研究。E-mail：zhiguo-yu@163.com

#通信作者2：主治医师。研究方向：癫痫的诊断与治疗。E-mail：lianghong4758@163.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.03.032