高效液相色谱法测定消疕丸中绿原酸的含量

王本晓，孙立伟

(济南市中医医院药剂科，山东 济南 250012)

高效液相色谱法测定消疕丸中绿原酸的含量

王本晓*，孙立伟

(济南市中医医院药剂科，山东 济南 250012)

目的：采用高效液相色谱法测定消疕丸中绿原酸的含量。方法：色谱柱为ODS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液(V∶V=30 ∶70)，检测波长为327 nm，柱温为25 ℃，流速为1.0 ml/min，进样量为20 μl。结果：绿原酸进样量在0.176～1.056 μg(r=0.999 7)范围内线性关系良好，平均回收率为97.06%，RSD=1.02%。结论：本方法简单、易行，重现性好，专属性强，可用于消疕丸的质量控制。

消疕丸； 绿原酸的含量； 高效液相色谱法； 质量标准

消疕丸是根据济南市中医医院名老中医经验方开发的制剂，由金银花、土茯苓、菝葜、山豆根、当归等多味药物组成，具有解毒、活血、养阴清热、祛风润燥的功效，用于治疗银屑病(即牛皮癣)。为有效控制该制剂的质量，参照《中华人民共和国药典》及相关参考文献，本研究建立了高效液相色谱法测定金银花和菝葜中绿原酸的含量，为消疕丸的质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-100型高效液相色谱仪(上海伍丰科学仪器有限公司)，二极管阵列检测器(岛津SPD-M20A)，Arcus 5型自动进样器(Exformma Technologies)；FA2004型精密电子天平(天津天马衡基仪器有限公司)；双列六孔仪表恒温水浴锅(龙口市电炉制造厂)；DS3120型超声波清洗器(Tianjin Do-Chrom Technology Co.,Ltd.)。

1.2 药品与试剂

消疕丸(济南市中医医院制剂室提供，批准文号：鲁药制字Z0180219，批号：20160301、20160405、20160512)；绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110753—200403)；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适应性考察

色谱柱为岛津WondaCract ODS C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液(V∶V=30 ∶70)，检测波长为327 nm，柱温为室温(25 ℃)，流速为1.0 ml/min，进样量为20 μl，理论塔板数按绿原酸峰计算应≥1 000。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸对照品22.0 mg，置于25 ml棕色容量瓶中，加入甲醇适量，超声使其溶解，用甲醇稀释至刻度，作为对照品储备液。精密量取该储备液1 ml，置于50 ml容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得对照品溶液(质量浓度为17.6 μg/ml)。

2.3 供试品溶液的制备

取粉碎后的消疕丸粉末1 g，精密称定，置于100 ml具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，称定质量，超声提取30 min(功率150 W，频率20 kHz)，冷却后，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1.0 ml，置于5 ml容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 专属性试验

取除金银花和菝葜外的处方量药材，按消疕丸制备工艺及“2.3”项下方法制成阴性对照溶液。按照“2.1”项下方法进样测定，结果显示，阴性对照溶液在与绿原酸相应的保留时间处无色谱峰，表明处方中的其他组分对绿原酸含量测定无干扰，见图1。

A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液；1.绿原酸A.reference solution；B.test solution；C.negative reference solution；1.chlorogenic acid图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 线性关系考察

分别精密量取“2.2”项下对照品储备液0.10、0.15、0.25、0.40、0.60 ml，置于10 ml容量瓶中，分别加入50%甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取20 μl，按照“2.1”项下方法进样测定，记录峰面积。以绿原酸进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程Y=4×106X-131 485(r=0.999 7)，结果显示，绿原酸进样量在0.176～1.056 μg范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验

精密量取“2.2”项下对照品溶液20 μl，按照“2.1”项下方法进样6次，测定峰面积。结果显示，峰面积的RSD=0.46%，仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取同一批(批号：20160301)样品适量，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于室温(25 ℃)下放置0、2、4、8、24 h时按照“2.1”项下方法进样测定，记录峰面积。结果显示，RSD=1.13%，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

精密称取同一批号(批号：20160301)样品适量，按照“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，分别按照“2.1”项下方法进样测定，记录峰面积并计算含量。结果表明，绿原酸平均含量为4.5 mg/g，RSD=1.02%(n=6)，本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

精密量取已知绿原酸含量的消疕丸样品溶液共9份，每份2 ml，3份为1组，分别置于10 ml容量瓶中，每组依次精密加入绿原酸对照品溶液(质量浓度为88 μg/ml)1、2、3 ml，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，按照“2.1”项下方法进样测定，记录峰面积并计算绿原酸回收率，结果见表1。

表1 绿原酸的加样回收率试验结果

2.10 样品含量测定

取3批消疕丸样品，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并代入线性方程计算含量。结果显示，3批供试品的绿原酸含量分别为4.52、4.26、4.38 mg/g。

3 讨论

银屑病属于中医“白疕”的范畴，中医药治疗银屑病历史悠久[1-2]。研究结果表明，土茯苓为治疗银屑病的要药[3]；金银花、土茯苓为治疗银屑病的常用组合[4-5]；而当归、土茯苓组合用于斑块型银屑病有不同的生物学通路，具有协同作用[6]；菝葜对银屑病的治疗作用也得到了临床验证[7]；山豆根与土茯苓配伍用于治疗银屑病可起到减毒增效的作用[8]。济南市中医医院名老中医经验方消疕丸组方科学、配伍合理，其疗效已得到现代临床研究的证实，为进一步深入开发，首先应提高其质量控制水平。

消疕丸处方中金银花和菝葜都含有绿原酸，故以绿原酸含量为指标，进行高效液相色谱法测定研究[9]。在实际生产中，采用70%乙醇提取可提高金银花药材中绿原酸的提取率[10]，但消疕丸是原药粉压片，不存在提取率的问题。为方便高效液相色谱法测定，本研究参考《中国人民共和国药典》中的方法采用50%甲醇为溶剂制备供试品溶液，而结果表明，超声提取30 min已达最大提取率。《中国人民共和国药典：一部》(2015年版)规定按干燥品计算金银花中绿原酸的含量应不低于1.5%[11]，而帅丽乔娃、潘永芳等[12-13]均研究了菝葜中绿原酸的提取工艺，结果显示，绿原酸的平均提取率分别为0.93%、1.32%。根据金银花和菝葜在本方中的处方量，计算消疕丸中绿原酸的理论含量约为0.45%，实测数据与此相符，考虑到饮片质量可能存在的差异及制剂工艺等因素对含量的影响，建议将消疕丸质量标准定为绿原酸含量不低于0.4%。

随着药品再注册要求的不断提高，为保障临床用药安全有效，从根本上提高医疗机构制剂质量控制水平的工作势在必行[14]。一方面，质量是生产出来的，李茜等[15]将品管圈活动应用于医院制剂生产质量的持续改进中，优化了工艺流程、提高了生产效率，获得了较好的成效；另一方面，检验是保证质量的重要防线，在进行质量标准提高工作的过程中，要结合各品种的具体情况，并参考《中国人民共和国药典》及有关文献，严格进行方法学验证，以科学严谨的态度做好质量标准提高工作，使医院制剂更好、更安全地服务于临床。本研究建立了消疕丸中绿原酸的HPLC含量测定方法，该方法简便、准确、重现性好，可有效控制消疕丸的质量。

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[15] 李茜，郑东升，杭汉强，等.品管圈在医院制剂生产质量持续改进中的应用与成效[J].中国药房，2014，25(33)：3112-3115.

Content Determination of Chlorogenic Acid in Xiaobi Pills by HPLC

WANG Benxiao,SUN Liwei

(Dept.of Pharmacy, Jinan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shandong Jinan 250012, China)

OBJECTIVE：To determine the content of chlorogenic acid in Xiaobi pills by HPLC. METHODS: The chromatographic column was ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm), the mobile phase was methanol-0.2% phosphoric acid solution (V∶V=30 ∶70), with detection wavelength at 327nm, low rate of 1.0 ml/min, column temperature at 25 ℃, flow rate of 1.0 ml/min and sample size of 20 μl. RESULTS: Chlorogenic acid showed a good linear relationship in the range of 0.176 μg-1.056 μg (r=0.999 7).The average recovery was 97.06%,RSDwas 1.02%.CONCLUSIONS: This method is accurate and simple with good specificity and reproducibility.It can be used for the quality control of Xiaobi pills.

Xiaobi pills; Chlorogenic acid content;High performance liquid chromatography; Quality standard

R927.2

A

1672-2124(2017)03-0371-03

2016-11-18)

*主管药师。研究方向：中药的理论与应用研究。E-mail：wbx2001@126.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.03.031