龙香膏制备工艺的优化Δ

李怀国，刘东文，潘见欢，郑芳昊，陈淑映，蓝义琨

(佛山市中医院制剂中心，广东 佛山 528000)

龙香膏制备工艺的优化Δ

李怀国*，刘东文，潘见欢，郑芳昊，陈淑映，蓝义琨

(佛山市中医院制剂中心，广东 佛山 528000)

目的：优化龙香膏的制备工艺。方法：以药物投料质量、基质质量和促渗剂质量为考察因素，以24 h内西贝母碱的体外累积渗透量为指标，采用正交试验设计法优化龙香膏的制备工艺。结果：促渗剂质量对西贝母碱体外累积渗透量有显著影响，各因素影响程度为促渗剂质量>药物投料质量>基质质量。龙香膏的最佳制备工艺为药物投料质量35 g、基质质量65 g、促渗剂质量1.5 g。结论：本研究优化的龙香膏制备工艺增强了西贝母碱的体外累积渗透量，有利于其渗透入皮肤进而到达患处。

龙香膏； 西贝母碱； 制剂工艺

龙香膏是佛山市中医院研制的医院制剂，具有收湿敛疮、散结消肿、解毒生肌的功效，临床主要用于治疗湿热肿毒、疮疡不敛等[1]。龙香膏由炉甘石、川贝母、龙脑等8味药材组成。其中，炉甘石收湿敛疮、解毒生肌，为君药；川贝母散结消肿，为臣药，均是本方的重要组成药味[2-3]。龙脑具有清热解毒、生肌的功效，在方中既是具有一定治疗作用的组成药味，也是软膏剂的促渗剂，可帮助方中有效成分渗透进入皮肤[4-7]。龙香膏作为外用软膏剂，其组方具有内外兼顾的特点：一方面，炉甘石等矿物药在皮肤表面收湿敛疮，减小疮疡面；另一方面，川贝母等药味的有效成分透过皮肤作用于患处，起到散结消肿的功效。通常矿物药作用于皮肤表面，其量效关系较明确。而需要透皮吸收药物的量效关系相对复杂，与药物本身性质、基质质量和促渗剂的使用密切相关。龙香膏的原配方投料、基质、促渗剂(龙脑)质量比为30 ∶70 ∶1，而临床观察到其透皮吸收效果不够理想，散结消肿作用相对缓和，无法及时减轻患者的病痛。因此，本研究在前期工作基础上，以川贝母的有效成分西贝母碱为指标，考察了药物投料质量、基质质量和促渗剂质量对龙香膏体外累积渗透量的影响。

1 材料

1.1 仪器

Angilent 7530G型紫外-可见分光光度计(美国安捷伦科技有限公司)。

1.2 药品与试剂

西贝母碱对照品(批号：1213511-2012521，购自中国药品生物制品检定所)；龙香膏(佛山市中医院，批号：1521232)；浓氨试液(北京华科盛精细化工产品贸易有限公司)、三氯甲烷(东营市硕驰化工有限公司)、溴甲酚绿(沈阳先创化工有限公司)、磷酸二氢钾(廊坊鹏彩精细化工有限公司)、甲醇(无锡市展望化工有限公司)、氢氧化钠(天津市凯通化学试剂有限公司)等试剂均为分析纯。

1.3 动物

SD雄性大鼠(SPF级)20只，平均体质量(200±20) g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(粤)2008-0021。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液：取西贝母碱对照品适量，精密称定，加入三氯甲烷制成每1 ml含西贝母碱0.2 mg的溶液，即得。

2.1.2 缓冲溶液：取溴甲酚绿0.05 g，加入0.2 mol/L氢氧化钠溶液6 ml进行溶解，加磷酸二氢钾1 g，加水使溶解并稀释至100 ml，即得0.05%溴甲酚绿缓冲溶液。

2.1.3 供试品溶液：取样品约2.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入浓氨试液3 ml及三氯甲烷-甲醇(V∶V=4 ∶1)混合溶液40 ml，于80 ℃水浴加热回流2 h，放冷，滤过。滤液置于50 ml容量瓶中，取适量三氯甲烷-甲醇(V∶V=4 ∶1)混合溶液清洗药渣2～3次，并稀释至刻度。精密量取上述溶液5 ml，置于25 ml具塞试管中，水浴蒸干，精密加入三氯甲烷10 ml溶解，即得。

2.2 紫外-可见分光光度法测定西贝母碱的含量

2.2.1 波长的选择：根据仪器软件设置相应的参数，取“2.1.1”项下对照品溶液进行全波长扫描，根据扫描结果选择最大吸收波长。结果表明，西贝母碱的最大吸收波长为417 nm，见图1。

图1 对照品溶液的全波长扫描图Fig 1 Full wavelength scanning figure of reference solution

2.2.2 线性关系考察：分别精密量取“2.1.1”项下对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 ml，置于25 ml具塞试管中，分别加入三氯甲烷至10 ml，并加入精密量取的水5 ml及“2.1.2”项下缓冲溶液2 m1，密塞，剧烈振摇，转移至分液漏斗中，放置30 min。取三氯甲烷溶液，用干燥滤纸滤过，以续滤液为空白，采用紫外-可见分光光度法，在417 nm的波长下测定吸光度。以吸光度为纵坐标(Y)，浓度为横坐标(X)进行线性回归，得西贝母碱的回归方程为Y=0.235 6X+0.002 1，r=0.999 8。结果表明，西贝母碱质量浓度在2.0～20.0 μg/ml范围内线性关系良好，见图2。

图2 西贝母碱的标准曲线Fig 2 The regression equation of sipeimine

2.2.3 精密度试验：量取“2.1.1”项下对照品溶液适量，取三氯甲烷溶液，用干燥滤纸滤过，以续滤液为空白，采用紫外-可见分光光度法，在417 nm的波长下连续测定6次吸光度。结果表明，RSD=1.21%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.2.4 稳定性试验：取“2.1.3”项下供试品溶液适量，分别于放置0、2、4、8、12、24 h时测定西贝母碱含量。结果表明，RSD=1.34%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好，可以用于样品的含量测定。

2.2.5 加样回收率试验：取已知含量的样品适量，共6份，分别加入一定量的西贝母碱对照品，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，加入精密量取的水5 ml及“2.1.2”项下缓冲溶液2 m1，密塞，剧烈振摇，转移至分液漏斗中，放置30 min。取三氯甲烷溶液，用干燥滤纸滤过，以续滤液为空白，在417 nm的波长下测定吸光度。结果表明，平均加样回收率为97.75%，RSD=0.32%，说明西贝母碱在样品处理过程中损失较少，方法可靠。

2.3 体外透皮试验

2.3.1 离体皮肤的制备：选取腹部皮肤无明显异变的成年健康SD大鼠，均匀涂抹脱毛膏脱毛，开始前断头处死，小心剪下腹部皮肤，剔除皮下组织和脂肪等皮肤黏连物，采用0.9%氯化钠溶液洗净，备用。

2.3.2 累积渗透量的计算：将皮肤固定于扩散池接口，角质层面向供给室，真皮层面向接收室。打开恒温水浴循环[(37±1) ℃]和磁力加热搅拌器(300 r/min)适应1 h。待系统稳定后，在皮肤表面均匀涂抹软膏剂，以0.9%氯化钠溶液为接收液在设定时间点0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0 h分别从接收室内取样1 ml，并及时补充接收液。样品经0.45 μm微孔滤膜过滤后，采用紫外-可见分光光度法测量西贝母碱的含量，按以下公式计算累积渗透量(Qt)，Qt=(Cn×V+∑Ci×Vi)/A(Cn为不同取样点时接收液的浓度，Ci为各取样点时取样液的浓度；V和Vi分别为接收室体积和取样体积；A为透皮扩散面积)[8]。

2.3.3 回收率测定：精密量取皮肤接收液样品适量，共6份，分别加入一定量的西贝母碱对照品，用适量三氯甲烷溶解，参照“2.2”项下紫外-可见分光光度法进行测定。结果表明，平均回收率为101.13%，RSD=2.14%，说明操作过程中西贝母碱损失较少，不影响测定结果。

2.4 正交试验设计法优化工艺

以药物投料质量(A)、基质质量(B)和促渗剂(龙脑)质量(C)3个因素为考察指标，每个因素设置3个水平(见表1)，按照L9(34)正交试验表设计试验，分别制备龙香膏样品。参照“2.3”项下方法进行体外透皮试验，以24 h内西贝母碱的体外累积渗透量为指标，考察不同因素对渗透作用的影响。采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。结果表明，影响西贝母碱累计渗透量的因素C>A>B，即促渗剂质量是主要影响因子，药物投料质量次之，基质质量影响相对较小，见表2。极差分析结果表明，龙香膏处方的最优配比为A2B2C3，即药物投料质量为35 g、基质质量为65 g、促渗剂质量为1.5 g，见表3。

表1 因素与水平

表2 正交试验设计与结果

表3 方差分析结果

注：F0.05(2，2)=19.00

Note：F0.05(2，2)=19.00

2.5 处方验证性试验

根据“2.4”项下优化的处方(A2B2C3)制备龙香膏样品6批。参照“2.3”项下体外透皮试验的方法，与优化前的6批样品进行对比研究。采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。结果表明，处方优化前龙香膏中西贝母碱的体外渗透累积量为(288.51±34.26) μg/cm2，优化后为(395.26±28.16) μg/cm2，为优化前的1.37倍，见图3。经t检验，组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)，说明该处方的渗透作用有所增加。

图3 龙香膏处方优化前后的累计渗透量Fig 3 The cumulative osmotic quantity of Longxianggao before and after optimization

3 讨论

川贝母在我国使用历史悠久，具有清热润肺、化痰止咳、散结消痈的功效，可用于治疗肺热燥咳、干咳少痰、阴虚劳嗽、痰中带血、瘰疬、乳痈、肺痈等。川贝母外用具有散结消肿的作用，在龙香膏中处于臣药的重要位置。川贝母的来源较多，化学成分也比较复杂，通常认为其有效成分为生物碱类化合物。历年的《中华人民共和国药典》均将西贝母碱含量作为川贝母质量控制的指标。由于西贝母碱属于甾体类生物碱，自身缺少光化学的特征，常用的光学检测器并不能对其进行很好的检测。目前，许多相关研究均采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)测定西贝母碱的含量，并使用蒸发光散射检测器(evaporative light-scattering detector，ELSD)。如许红莉等[9]采用HPLC法测定了半贝丸中腺苷、鸟苷、西贝母碱和西贝母碱苷的含量；高森等[10]采用HPLC-ELSD测定了猴枣牛黄散中乔松素、小豆寇明、西贝母碱和西贝母碱苷的含量；霍务贞等[11]采用HPLC-ELSD测定了蛇胆川贝散生产过程西贝母碱的含量变化；蔡晓翠等[12]采用HPLC-ELSD测定了新疆道地药材伊贝母的西贝母碱含量；段宝忠等[13]采用UPLC-ELSD法同时测定了伊贝母中贝母辛和西贝母碱的含量。而《中华人民共和国药典》(2015年版)“川贝母”项下收录的西贝母碱含量测定方法为紫外-可见分光光度法[14]，相比HPLC技术，该方法精密度和准确度略低，但是操作简便，即使在实验条件稍差的单位也可实现。本研究结果表明，紫外-可见分光光度法可用于龙香膏中西贝母碱的含量测定。

累积渗透量是评价完整皮肤外用制剂质量的重要指标，测定方法包括在体和离体2种方式。通过体外透皮试验，可以初步了解软膏剂的渗透性能，为处方筛选提供参考依据。透皮过程除与皮肤自身情况有关外，还主要与药物性质、基质组成和促渗剂的使用等有关。常用的促渗剂有氮酮、油酸、乙醇、丙二醇及萜烯类等。龙脑是龙香膏的重要组成药味，具有解毒生肌的功效。同时，龙脑也属于萜烯类促渗剂，其作用与氮酮类似，主要作用于表皮的角质层，通过破坏角化细胞间质，造成角质层裂解剥脱，促使表皮细胞间裂隙增大，最终减轻皮肤对药物的阻滞作用[15]。本研究以西贝母碱累积渗透量为指标考察龙香膏的渗透作用，而促渗剂(龙脑)质量是其关键影响因素。在一定范围内，增加处方中龙脑的比例，有助于有效成分渗透进入皮肤到达患处。

但值得注意的是，药物透皮吸收过程受多种因素的影响。体外透皮试验模型虽然尽力考虑了透皮吸收的影响因素，并在温度控制、进样孔封闭与否、pH、搅拌方式、驱动方式及连续自动测定等方面进行了多次改进[16-18]，但目前尚无法完全替代体内透皮吸收的情况。因此，本研究的相关结果尚需在活体动物模型上进一步验证。

综上所述，紫外-可见分光光度法可用于测定龙香膏中西贝母碱的含量。本研究通过体外透皮试验优化了龙香膏的制备工艺，为制剂工艺的提高奠定了基础。

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Study on Preparation Process of LongxianggaoΔ

LI Huaiguo, LIU Dongwen, PAN Jianhuan, ZHENG Fanghao, CHEN Shuying, LAN Yikun

(Dept.of Drug Preparation Center, Foshan Hospital of Traditional Chinses Medicine, Guangdong Foshan 528000, China)

OBJECTIVE：To optimize the preparation process of Longxianggao. METHODS: To set the drug inventory, foundation quality and permeability dose of promotion as investigation factors and cumulative osmotic quantity in vitro of sipeimine within 24 h as indicators, preparation process were optimized by orthogonal experimental. RESULTS: The permeability dose of promotion had significant effects on cumulative osmotic quantity in vitro of sipeimine, the effective factors were permeability dose of promotion>drug inventory>foundation quality. The best preparation technology of Longxianggao was quality of drug release 35 g，foundation quality 65 g，the quality of permeability dose 1.5 g. CONCLUSIONS: The optimized preparation process of Longxianggao enhance the cumulative osmotic quantity in vitro of sipeimine, which helps to penetrate into the skin tissue.

Longxianggao; Sipeimine; Preparation process

2013年佛山市医学类科技攻关项目(No.201308114)

R943

A

1672-2124(2017)03-0318-04

2016-09-05)

*副主任药师。研究方向：中药制剂开发与质量研究。E-mail：2402811567@qq.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.03.010