先天性上斜肌麻痹性斜视患儿眼外肌NGF、GAP-43表达变化及意义

刘素江，韩惠芳，王世焕，王娟，代书英，刘雅丽，杜哲，韩爱军

(河北省眼科医院，河北邢台054000)

先天性麻痹性斜视是由于眼外肌肌肉、神经核、神经麻痹所致的眼外肌器质性病变，表现为单条或多条眼外肌的部分或完全麻痹[1]。根据先天性上斜肌麻痹性斜视的病变肌肉部位，可分为上斜肌麻痹性斜视及下斜肌亢进性斜视，其中上斜肌在该病中起到麻痹作用，而下斜肌在该病中起到亢进作用。通常表现为患眼向外上方斜视，若双眼发病时则为交替性外上斜。目前对于先天性上斜肌麻痹性斜视的发病机制尚不明确。近年研究证实，先天性上斜肌麻痹性斜视的发生与眼外肌本体感受器信号传输失调有关，神经营养因子在神经调节及信号传输过程中具有重要作用[2]。神经生长因子(NGF)及生长相关蛋白(GAP-43)是目前研究较多的两类神经营养因子，对促进神经再生长及调控神经功能具有重要作用[3]。2013年1月～2014年12月，我们检测了28例先天性上斜肌麻痹性斜视患儿上下斜肌组织中NGF及GAP-43的表达，探讨NGF及GAP-43在先天性上斜肌麻痹性斜视发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取同期在我院行斜视矫正手术治疗的先天性上斜肌麻痹性斜视患儿28例，男 16例、女12例，年龄3～12(6.32±2.12)岁，临床表现为患眼向外上方斜视、代偿头位、面部发育不对称。根据病变部位分为上斜肌(斜视上斜肌组)15例、下斜肌(斜视下斜肌组)13例。纳入标准：无明显屈光不正；经戴棱镜矫正治疗1年以上视力无明显改善；为上斜肌或下斜肌单条肌肉病变。排除标准：有外伤史、既往手术史、合并严重心肝肾功能不全、合并恶性肿瘤、因其他眼外肌所致的斜视。另选取同期无眼部疾病、因眼外伤导致眼球破裂行眼球摘取手术的患儿30例，男16例、女14例，年龄3～12(6.47±2.12)岁，术中取正常上斜肌(正常上斜肌组)、正常下斜肌(正常下斜肌组)组织各15例。两组性别、年龄差异无统计学意义。患儿家属均签署知情同意书，愿意参与本研究。

1.2 上下斜肌组织病理改变观察 采用HE染色法。将各组上下斜肌组织置入2.5%戊二醇中，制备HE染色标本，光镜下观察各组上下斜肌组织病理改变。

1.3 上下斜肌组织NGF及GAP-43蛋白表达检测 采用免疫组化染色法。取各组上下斜肌组织制备石蜡切片，经微波加热、抗原修复后，加入一抗试剂二氨基联苯胺(美国Dako公司)，4 ℃孵育24 h。分别加入二抗试剂NGF及GAP-43单克隆抗体(美国Sigma公司)，室温孵育1 h。DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片。采用PH7.4浓度为0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液作为阴性对照。采用电子显微镜观察标本情况，由两名病理师分别进行阅片，结果一致时作为确诊结果。染色深度评分：不显色或显色模糊为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；褐黄色为3分。染色面积：0%～5%为0分，>5%～35%为1分，>35%～65%为2分，>65%为3分。将染色深度评分与染色面积评分相加后取平均值，作为蛋白表达强度，得分0.5～1为1分，1.5～2.0为2分，2.5～3.0为3分，以得分≥2分计为阳性表达。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件。组间计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组上下斜肌组织病理改变 光镜下可见，正常上、下斜肌组细胞核数量正常、肌细胞体积无明显改变、肌纤维排列错落有致、肌小节结构清晰、线粒体无变性、肌细胞肌节正常、肌原纤维排列一致。斜视上斜肌组细胞核数量减少、肌细胞萎缩、肌纤维排列紊乱及水肿、肌小节结构模糊、线粒体空泡样变性、肌细胞肌节紊乱、肌原纤维排列弯曲。斜视下斜肌组肌细胞内纤维弯曲排列，肌节紊乱，肌节线模糊，线肌消失，肌细胞内线粒体增生并伴有不同程度空泡样变肌水肿，细胞器数目增加，间质增宽。

2.2 各组NGF蛋白表达比较 正常上斜肌组、斜视上斜肌组NGF蛋白阳性表达率为分别为80.0%(12/15)、46.7%(7/15)，正常下斜肌组、斜视下斜肌组NGF蛋白阳性表达率分别为73.3%(11/15)、84.6%(11/13)。斜视上斜肌组NGF蛋白阳性表达率低于正常上斜肌组，斜视下斜肌组NGF蛋白阳性表达率高于正常下斜肌组(P均<0.05)。

2.3 各组GAP-43蛋白表达比较 正常上斜肌组、斜视上斜肌组GAP-43蛋白阳性表达率分别为73.3%(11/15)、33.3%(5/15)，正常下斜肌组、斜视下斜肌组GAP-43蛋白阳性表达率分别为60.0%(9/15)、84.6%(11/13)。斜视上斜肌组GAP-43蛋白阳性表达率低于正常上斜肌组，斜视下斜肌组GAP-43蛋白阳性表达率高于正常下斜肌组(P均<0.05)。

3 讨论

眼外肌属于横纹肌，是由许多肌纤维组成的，每条肌纤维包含了许多肌管系统及肌原纤维。肌原纤维由粗细肌丝组成，整齐排列，具有横纹外观[4]。先天性上斜肌麻痹性斜视由于配偶肌及拮抗肌功能过强，导致拮抗肌功能减弱，使拮抗肌形态发生变化。近年研究发现，先天性上斜肌麻痹性斜视在双眼视觉反射建立前已经发生斜视度较小、眼外肌功能不足、视功能发育异常的情况[5]。国外研究指出，肌纤维横截面与患者年龄、病程无相关性，而与下斜肌亢进程度有密切关系[6]。李丽等[7]研究发现，具有单个运动终板的纤维肌可通过增加肌纤维横截面积从而引起肌细胞肥大，并表现为肌纤维长度及运动终板肌纤维增加。

先天性上斜肌麻痹性斜视根据病变部位可分为上斜肌麻痹性斜视及下斜肌亢进性斜视。上斜肌麻痹后会导致其配偶肌及拮抗肌功能过强，而间接拮抗肌功能减弱，主要表现为肌组织轻度变性，肌小节结构异常，肌细胞内线粒体堆积并形成空泡。下斜肌主要功能为收缩时产生外旋作用力，当其麻痹发生病变后，下斜肌麻痹会导致肌细胞内纤维弯曲排列，肌节紊乱，肌节线模糊，线肌消失，肌细胞内线粒体增生，并伴有不同程度空泡样变肌水肿，细胞器数目增加，间质增宽。本研究发现，斜视上斜肌组细胞核数量减少、肌细胞萎缩、肌纤维排列紊乱及水肿、肌小节结构模糊、线粒体空泡样变性，肌细胞肌节紊乱、肌原纤维排列弯曲，提示病变上斜肌呈退行性病变、萎缩表现；下斜肌组肌细胞内纤维弯曲排列，肌节紊乱，肌节线模糊，线肌消失，肌细胞内线粒体增生并伴有不同程度空泡样变肌水肿，细胞器数目增加，间质增宽，提示病变下斜肌出现肌肉肥大、功能亢进表现。

Huawei等[8]研究指出，肌细胞与运动神经元间存在依赖于神经冲动的复杂关系，肌细胞正常生理结构的维持需要依靠神经营养因子，当神经营养因子丢失后会导致肌肉生理结构、新陈代谢等方面发生变化。NGF及GAP-43是目前研究较深入的神经营养因子，对外周神经再生及信号传导具有重要的作用。NGF具有较强的促进感觉纤维再生的功能，而GAP-43可促进运动纤维再生[9]。NGF对运动神经、感觉神经、交感神经具有良好的促进作用，具有促进神经元再生、细胞肥大及神经突起生长的作用[10,11]。Wasternack等[12]研究认为，GAP-43是一种神经源性肌肉营养因子，具有肌肉和神经双重调节作用，在肌肉退性病变、运动神经元疾病及神经肌肉损伤治疗中起到重要作用。本研究结果显示，斜视上斜肌组NGF及GAP-43蛋白阳性表达率均低于正常上斜肌组，斜视下斜肌组NGF及GAP-43蛋白阳性表达率均高于正常下斜肌组，提示先天性上斜肌麻痹性斜视的发生与麻痹斜肌中NGF及GAP-43表达异常有关，结合病理学观察结果，考虑先天性上斜肌麻痹性斜视患者的病变上斜肌呈退行性病变、萎缩，可能与NGF及GAP-43活性下降有关，而病变下斜肌出现肌肉肥大、功能亢进表现，可能与NGF及GAP-43活性增加导致肌纤维长度增加有关。

综上所述，NGF及GAP-43蛋白在先天性上斜肌麻痹性斜视发病中具有重要作用，通过加强或拮抗NGF及GAP-43蛋白的表达对先天性上斜肌麻痹性斜视的治疗具有一定指导意义。