下调Nek2表达对肾癌细胞侵袭、迁移的影响

何云，黄璀

(武汉市普爱医院，武汉430000)

肾细胞癌是常见的实体肿瘤之一，近年来发病率逐渐上升[1]。尽管早期、局限性的肾癌经放疗及手术治疗后能取得较好的效果，但20%～40%的患者术后仍出现转移，中位生存期仅1.5年，生存期超过5年者仅不到10%[2～4]。因此，对于肾癌迁移及侵袭机制的研究已成为肾癌研究领域的热点。中心体相关激酶2(Nek2)是一种与中心体结构类似的、具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞周期调控蛋白[5,6]。Nek2可通过稳定微管中心体复制和分离过程、着丝粒附着和纺锤体组装的检查点等，对细胞周期发挥调控作用[7,8]。近年研究发现，Nek2可通过增加肿瘤形成、耐药、侵袭等机制促进乳腺癌[9]、肝癌[10]、肺癌[11]的发生及转移。但目前对Nek2在肾癌转移中的作用及机制尚不明确。2015年1月～2016年1月，我们观察了下调Nek2表达对肾癌细胞系A498细胞迁移及侵袭的影响，探讨Nek2在肾癌细胞迁移与侵袭中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及材料 人肾癌细胞系A498细胞购自北京协和医学院实验中心。RNA反转录试剂盒购自美国Thermo公司；一抗均购自美国Abcam公司；二抗购自北京中杉金桥公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Matrigel胶购自美国BD公司；Nek2抑制剂INH6购自北京爱普拜生物技术有限公司；DMEM、胰蛋白酶、FBS购自美国Gibico公司。

1.2 细胞培养与分组 将A498加入DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，48 h后传代，将细胞分为观察组、对照组，分别给予100 mmol/L的Nek2抑制剂INH6及等体积DMSO，培养14 h。

1.3 Nek2 mRNA表达检测 采用q-RT-PCR法。使用TRIzol法提取A498细胞总RNA。设计引物序列：Nek2正义链5′-CATTGGCACAGGCTCCTAC-3′，反义链5′-GAGCCATAGTCAAGTTCTTTCCA-3′；GAPDH正义链5′-TATGCTCTCCTCATGCATTG -3′，反义链5′-GGGACG-ACCTTCGATCTACC-3′。按TAKARA SYBR Premix Ex Taq反应体系进行PCR扩增反应。以GAPDH基因为内参，采用2-ΔΔCt法计算Nek2 mRNA的相对表达量。

1.4 Nek2蛋白表达检测 采用Western blot法。收集两组细胞，加入裂解液提取细胞总蛋白，以每孔20 μg总蛋白上样，浓缩胶80 V电泳50 min，分离胶100 V电泳2 h，湿法转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入Nek2(1∶500)和β-actin(1∶200)一抗，4 ℃孵育过夜，加入相应二抗(1∶1 000)，ECL显影，Quantity One 1-D分析软件对蛋白质印迹条带进行定量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白测定值/ β-actin。

1.5 细胞侵袭能力测定 采用Transwell细胞侵袭实验。两组各取1×106个细胞，在Transwell上室加入细胞悬液200 μL，并设立3复孔，下室加入常规培养基(DMEM+10%FBS)600 μL，细胞侵袭14 h后，去除上室面细胞，结晶紫染色后，使用显微镜在20倍视野下计算穿过的细胞数评估侵袭能力变化。实验重复3次，取平均值。

1.6 细胞迁移能力测定 采用细胞划痕实验。将两组细胞培养于6孔板中，待细胞贴壁融合后，使用10 μL枪尖进行划痕，并在划痕后0、24 h在显微镜下观察细胞划痕修复情况，使用Wimscratch在线图像分析系统测定细胞划痕面积，计算划痕愈合率，划痕愈合率=(划痕后即刻的划痕面积-划痕后48 h的划痕面积)/划痕后即刻的划痕面积×100%。实验重复3次，取平均值。划痕愈合率越高，表示细胞迁移能力越强。

2 结果

2.1 两组Nek2 mRNA表达比较 对照组和观察组Nek2 mRNA表达量分别为1.00±0.01、0.22±0.01，观察组Nek2 mRNA表达量低于对照组(P<0.01)。

2.2 两组Nek2蛋白表达比较 对照组、观察组Nek2蛋白表达量分别为1.56± 0.12、0.56± 0.10，观察组Nek2蛋白表达量低于对照组(P<0.01)。

2.3 两组侵袭能力比较 对照组、观察组侵袭细胞数分别为(428.8±18.1)、(128.2±46.9)个，观察组侵袭细胞数低于对照组(P<0.01)。

2.4 两组迁移能力比较 对照组、观察组划痕愈合率分别为86.3%±5.7%、53.2%±3.4%，观察组划痕愈合率低于对照组(P<0.01)。

3 讨论

虽然肾癌对于放疗与手术治疗十分敏感，但肾癌转移仍是影响患者生存的重要因素。目前对肾癌转移机制的研究主要集中于肾癌细胞侵袭潜能的改变[12]、胞外基质降解增强[13]、血管形成[14]等方面。

Nek家族包括Nek1～11，其中Nek2与中心体的序列最为相似，Nek2位于染色体1q32.2-1q41[6]，Nek2的表达包括3个可变剪切体Nek2A、Nek2B和Nek2C，其中以Nek2A在肿瘤组织最常见[7]。尽管Nek2在进化中处于相对保守，但其已被证实在多种肿瘤如肝癌[10]、前列腺癌[15]、卵巢癌[16]的侵袭、迁移中发挥重要作用。研究发现，Nek家族广泛参与调节肿瘤增殖和转移过程。在肝癌组织中，Nek2主要通过MAPK通路抑制肝癌细胞的转移[10]；在前列腺癌组织中，Nek2通过PI3K-AKT-mTOR信号通路改变细胞增殖[15]；在卵巢癌组织中，Nek2则通过ERK信号转导通路改变SKOV3卵巢癌细胞系的生物学行为[16]。Nek2与肾细胞癌之间的联系已有研究，使用基因富集分析乳头状肾细胞癌发现，染色体1q中的Nek2、KIF14等基因的富集以及表达量的增加与乳头状肾细胞癌的进展密切相关，并在致死患者中的基因拷贝数显著增加[17]。在肝癌中，Nek2的下调能够抑制HepG2细胞增殖，促进凋亡，同时抑制迁移[18]。Nek2也被认为是一个重要的肝癌预后与进展的标记物。在结肠癌中，Nek2受到microRNA-128甲基化的调控，同时Nek2过表达的患者预后显著变差[19]。Nek2对肿瘤的作用与其功能相关，在细胞分裂中，Nek2在有活性的状态下能够诱导不成熟的中心体分裂，从而使得中心粒的内聚力丧失，Nek2在无活性状态下则能够导致中心体异常、单极纺锤体以及非整倍体的形成，以上均为导致肿瘤发生发展的重要因素[20]。低等真核生物与细胞实验中，Nek2过表达能够使染色体呈5～10倍的增加，意味着多倍体的出现与异常染色体的出现[21]。因此Nek2是一种极其重要的癌基因。但Nek2与肾癌发病的关系尚未明确。本研究发现，观察组Nek2 mRNA及蛋白表达量均低于对照组，提示Nek2抑制剂INH6可显著下调Nek2的表达；观察组侵袭细胞数低于对照组、细胞划痕愈合率低于对照组，提示Nek2下调表达可显著抑制肾细胞癌的侵袭与迁移。

综上所述， 抑制Nek2的表达能够抑制肾癌细胞的侵袭与迁移，Nek2可能参与了肾癌侵袭与迁移的过程。